Obserwacje mikroskopowe

Ze względu na ograniczenia ludzkiego narządu wzroku obserwacja wielu aspektów budowy i funkcji organizmów żywych nie jest możliwa bez specjalistycznej aparatury. Z tego powodu większości przełomowych odkryć z zakresu nauk biologicznych dokonano dzięki wynalezieniu mikroskopu – przyrządu optycznego pozwalającego na otrzymywanie powiększonych obrazów. Stał się on ważnym narzędziem badawczym w wielu dziedzinach biologii. Pierwsze mikroskopy, skonstruowane w XVI w., miały jedynie 10‑krotne powiększenie; obecnie możliwe jest oglądanie obiektów pod powiększeniem nawet 3 000 000 razy.

R1Dc2KqIzKdHx1

Ilustracja przedstawia porównanie zdolności rozdzielczej oka ludzkiego i mikroskopów: elektronowego i optycznego. Na dole rysunku jest podziałka, przedstawiająca wielkość organizmów, od jednego nanometra, czyli miliardowej części metra, do stu metrów. Nad nią w kolorowych czworokątach umieszczono obrazki różnych organizmów, zależnie od ich wielkości. Na przykład części komórek lub wirusy można zobaczyć tylko w mikroskopie elektronowym. Bakterie, krwinki lub pantofelka można obserwować przez mikroskop optyczny. Jajo kurze, słonia lub sekwoję zobaczymy gołym okiem.

W podstawowych badaniach biologicznych wykorzystuje się przede wszystkim mikroskopy optyczne oraz mikroskopy elektronowe, które różnią się między sobą nie tylko zakresem powiększenia, lecz także zdolnością rozdzielczą.

Zdolność rozdzielcza to najmniejsza odległość między dwoma punktami, przy której są one widziane oddzielnie. Dla ludzkiego oka wynosi ona 0,1 mm, co pozwala dostrzec obiekty większe od tej wartości, jak większość roślin, zwierząt czy owocniki grzybów. Jednak komórki tych organizmów, mające od 10 do 100 μmum, są już niewidoczne „gołym okiem”.  Obserwacje takich niewielkich obiektów wymagają użycia mikroskopów, których zdolność rozdzielcza jest wielokrotnie większa niż możliwości ludzkiego oka. Dla mikroskopu optycznego wynosi ona  0,2 µm, natomiast dla mikroskopów elektronowych nawet 0,0002 µm.

Mikroskopy świetlne

Mikroskopy świetlne są rodzajem mikroskopów optycznych, w których do tworzenia obrazu wykorzystuje się światło widzialne. Choć źródło światła może być naturalne (światło słoneczne), obecnie częściej stosuje się sztuczne światło z zainstalowanej w mikroskopie żarówki lub diody. Wiele z promieni świetlnych, które padają na preparatpreparat mikroskopowypreparat zawierający materiał biologiczny, ulega częściowemu odbiciu lub pochłonięciu, ale pozostałe przenikają przez obserwowany obiekt.

Współczesne mikroskopy świetlne umożliwiają uzyskanie powiększeń do 1 500 razy, a ich maksymalna zdolność rozdzielcza to 0,2 µm.

Budowa mikroskopu świetlnego

W budowie mikroskopu świetlnego wyróżnia się dwa zestawy elementów tworzące układy optyczny i mechaniczny.

R1ZCGJR2EBFGL

Ilustracja przedstawia budowę mikroskopu optycznego. Jego części zostały podpisane na rysunku. Po lewej znajdują się podpisy części mechanicznych: tubus, statyw, rewolwer, stolik i śruby: mikrometryczna i mikrometryczna. Po prawej znajdują się podpisy części optycznych: okular, obiektywy, kondensor, źródło światła. Na górze mikroskopu widoczny jest podłużny, w kształcie walca okular, który przyłączony jest do prostokątnego tubusa, z którego wychodzi rewolwer i pociągłe obiektywy. Na boku widoczny jest statyw w kształcie litery C. Pod dwoma obiektywami znajduje się płaski stolik, poniżej kondensor i źródło światła.

Układ optyczny zapewnia oświetlenie obiektu i utworzenie jego obrazu, natomiast układ mechaniczny manipulację obiektem i układem optycznym.

Elementy budowy mikroskopu i ich funkcje:

• okular – pojedynczy lub podwójny, zbudowany z soczewek powiększających obraz;

• tubus – ruchoma obudowa, w której osadzone są okulary;

• rewolwer – obrotowa tarcza, na której umocowane są obiektywy o różnych powiększeniach;

• obiektyw – zbudowany z silnie powiększających soczewek, ustawiany bezpośrednio nad obserwowanym obiektem;

• statyw – na nim osadzone są wszystkie elementy mikroskopu;

• stolik – miejsce, gdzie umieszcza się preparat;

• śruba makrometryczna – służy do wstępnej regulacji odległości obiektywu od preparatu oraz ustawienia przybliżonej ostrości obrazu;

• śruba mikrometryczna – służy do precyzyjnego ustalania ostrości obrazu;

• kondensor – skupia światło na preparacie i równomiernie rozkłada je w polu widzenia;

• źródło światła – oświetla preparat.

Sposób działania mikroskopu świetlnego

Promienie świetlne docierają do układu optycznego, utworzonego z kilku soczewek umieszczonych w obiektywie i okularze. Soczewki te powiększają obraz obserwowanego przedmiotu. Niektóre elementy układu optycznego są ruchome, dzięki czemu użytkownik może właściwie zogniskować powstały obraz, by był ostry i wyraźny.

Obraz widziany z okularze mikroskopu świetlnego jest powiększony, rzeczywisty, odwrócony.

ROL2DvUROlfGn

Ilustracja przedstawia przekrój pionowy przez mikroskop. Przez części optyczne w kolorze szarym biegnie żółty pasek, pokazujący drogę światła do ludzkiego oka, znajdującego się nad mikroskopem. Światło biegnie od źródła światła znajdującego się w dolnej części mikroskopu, przechodzi przez otwór w stoliku i preparat, a następnie trafia do soczewki obiektywu. Światło wędruje w górę mikroskopu i wychodzi przez soczewkę okularu. Po przyłożeniu do niej oka można zobaczyć obraz preparatu.

Dla zainteresowanych

Jasne pole

Najczęściej stosowaną techniką obserwacji w mikroskopii świetlnej jest obserwacja w jasnym polu. W technice tej światło przechodzi przez preparat i trafia do obiektywu mikroskopu. W rezultacie obiekt jest widoczny jako ciemniejszy na jasnym tle.

R3U88ZUEDBNH6

Zdjęcie spod mikroskopu świetlnego z zastosowaniem metody jasnego pola w powiększeniu czterdziestokrotnym przedstawia zielenicę o nazwie skrętnica. Na zdjęciu znajduje się przezroczysty przewód podzielony na segmenty, a wzdłuż całego przekroju przewodu widoczna jest spiralnie ułożona, zielona struktura. Przewód znajduje się na jasnoszarym tle.

Ciemne pole

Inną techniką jest obserwacja w ciemnym polu. W technice tej, preparat oświetlany jest skośnie, a do obiektywu trafia tylko światło rozproszone na strukturach badanego obiektu. Powstający obraz jest jasny na ciemnym tle.

RSA32DGBU124V

Zdjęcie spod mikroskopu świetlnego z zastosowaniem metody ciemnego pola w powiększeniu czterdziestokrotnym przedstawia zielenicę o nazwie skrętnica. Na zdjęciu znajduje się przezroczysty przewód podzielony na segmenty, a wzdłuż całego przekroju przewodu widoczna jest spiralnie ułożona, zielona struktura. Przewód znajduje się na czarnym tle, zielona spirala jest lekko fosforyzująca.

Mikroskop kontrastowo‑fazowy

Mikroskop kontrastowo‑fazowy jest rodzajem mikroskopu świetlnego, w którym wykorzystywane jest zjawisko interferencji fal świetnychinterferencja falinterferencji fal świetnych i przesunięcia fazowegoprzesunięcie fazoweprzesunięcia fazowego światła przy przejściu przez obserwowany preparat. Umożliwia obserwację preparatów biologicznych, które są zbyt przezroczyste, by dostrzec szczegóły ich budowy w standardowym mikroskopie jasnego pola.

R1VKV4ZF4HQFK

Zdjęcie spod mikroskopu kontrastowo‑fazowego w powiększeniu czterdziestokrotnym przedstawia pantofelka. Pantofelek ma wydłużone ciało o charakterystycznym kształcie buta, z zewnątrz pokryte jest rzędami rzęsek. Otacza je żywa osłona. W środku znajdują się żółte, nieregularnie ułożone, okrągłe struktury. Widoczna jest również wodniczka tętniąca w kształcie słońca z odchodzącymi od centrum odnogami.

Zasady obsługi mikroskopu świetlnego

Mikroskop jest precyzyjnym urządzeniem. Aby obserwacja sprawiała przyjemność i pozwalała odkrywać świat w mikroskali, obserwator powinien umieć nastawić obraz w mikroskopie, sporządzić preparat mikroskopowy w kropli wody i za pomocą rysunku przedstawić szczegóły obserwowanego obrazu.

Ważne!

Obliczanie powiększenia mikroskopu:

powiększenie obrazu obserwowanego obiektu = powiększenie okularu · powiększenie obiektywu

RBXSK2ZOVVUKE

Film prezentujący zasady obsługi mikroskopu.

Film prezentujący zasady obsługi mikroskopu.

Film dostępny pod adresem /preview/resource/RBXSK2ZOVVUKE

Film prezentujący zasady obsługi mikroskopu.

Przygotowanie preparatu do mikroskopu świetlnego

W obserwacjach mikroskopowych często wykorzystuje się trwałe preparaty mikroskopowe kupione w specjalistycznych sklepach.

Preparaty można także przygotowywać samodzielnie. Do ich wykonania służy zestaw preparacyjny, składający się ze szkiełka do przygotowania preparatu i z przyborów do pobierania materiału biologicznego. Świeże preparaty mikroskopowe sporządzane są najczęściej w kropli wody, którą umieszcza się na szkiełku podstawowym i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym.

RlUq8EVFYseqN

Fotografia przedstawia przedmioty potrzebne do sporządzenia preparatu mikroskopowego. Każdy z nich jest oznaczony cyfrą od 1 do 8. Cyfrą 1 oznaczona jest zlewka z wodą. Cyfra 2 przedstawia pudełeczko z kwadratowymi, cienkimi szkiełkami nakrywkowymi, ułożonymi pionowo w dwóch zagłębieniach w gąbce. Cyfrą 3 oznaczono pojedyncze, prostokątne szkiełko nakrywkowe. Cyfra 4 to pipeta. Cyfra 5 to igła preparacyjna. Cyfra 6 to skalpel. Cyfra 7 to pęseta. Cyfrą 8 oznaczono trójkątne kawałki białej bibuły.

R2esn5gyP9APv

Animacja przedstawia kolejne etapy przygotowania preparatu mikroskopowego.

Animacja przedstawia kolejne etapy przygotowania preparatu mikroskopowego.

Film dostępny pod adresem /preview/resource/R2esn5gyP9APv

Animacja przedstawia kolejne etapy przygotowania preparatu mikroskopowego.

Dokumentowanie obserwacji mikroskopowej

Dokumentowanie obserwacji mikroskopowej polega na zapisaniu jej wyników. Obserwowane obiekty można fotografować za pomocą odpowiednio wyposażonego mikroskopu lub wykonać odręczne rysunki. Poprawnie wykonany szkic pomaga zrozumieć budowę obserwowanego obiektu.

Zasady sporządzania rysunku z obserwacji mikroskopowej:

• Rysunek i jego opis wykonaj w trakcie przeprowadzania obserwacji mikroskopowej. Użyj do tego dobrze zaostrzonego ołówka.

• Nie otaczaj rysunku okręgiem, aby oznaczyć pole widzenia.

• Rysuj, używając linii ciągłej, czystej. Nie cieniuj.

• Rysując, odwzoruj wiernie kształt i proporcje obserwowanego obiektu.

• Opisz rysunek, prowadząc linie proste od obiektu do jego nazwy.

• Nadaj rysunkowi tytuł i umieść go pod rysunkiem. Uwzględnij skalę powiększenia.

• Rysunek powinien zająć pół strony zeszytu.

RET6KAK2BE5UP

Ilustracja przedstawia mikroskop i obraz preparatu krwi żaby, czyli różowe owalne kształty z fioletowym środkiem. Po prawej na kartce z zeszytu znajduje się rysunek kilku komórek obserwowanego preparatu w powiększeniu czterysta razy. Na rysunku podpisano komórkę krwi i jądro komórkowe.

Znaczenie mikroskopii świetlnej

Mikroskopia świetlna jest niezwykle użyteczna w badaniach biologicznych. Umożliwia zaobserwowanie ruchu komórek (np. bakterii) lub procesów fizjologicznych, które zachodzą w żywych komórkach (np. podziały komórkowe). W mikroskopie świetlnym można również obserwować preparaty z martwych obiektów. Wymaga to jednak specjalnego przygotowania.

Mikroskop fluorescencyjny

Odmianą mikroskopu optycznego jest mikroskop fluorescencyjny, który do tworzenia obrazu wykorzystuje światło widzialne, ultrafioletowe i podczerwone. Mikroskopia fluorescencyjna opiera się na zjawisku fluorescencjifluorescencjafluorescencji, czyli świeceniu substancji po naświetleniu jej światłem o odpowiedniej długości fali. Fluorescencja może być naturalna (np. chlorofil po naświetleniu światłem niebieskie emituje światło czerwone) lub sztuczna, gdy pochodzi od specjalnych związków chemicznych - markerów fluorescencyjnychmarker fluorescencyjny (fluorochrom)markerów fluorescencyjnych, które dodaje się do preparatu w celu uwidocznienia określonych struktur komórkowych.

Mikroskopy fluorescencyjne pozwalają na powiększenie do 1 500 razy, a ich maksymalna zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm

Galeria zdjęć mikroskopii fluorescencyjnej:

R1SBUC86R8P24

Fotografia spod mikroskopu fluorescencyjnego przedstawia błonę komórkową drożdży w tysiąckrotnym powiększeniu. Jest to układ nieregularnie ułożonych na czarnym tle kolorowych kół. Białka błonowe oznaczone zostały markerami fluorescencyjnymi świecącymi na zielono i czerwono. Nałożenie tych dwóch barw daje na obrazie kolor żółty.

RO9SpdqjZHs06

Zdjęcie wykonane mikroskopem konfokalnym w powiększeniu sześćdziesięciokrotnym przedstawia liść zarodkowy rzodkiewnika pospolitego barwiony jodkiem propidyny na czarnym tle. Ma kolor żółty, owalny kształt, jest podzielony na szereg niewielkich, nieregularnych, przylegających do siebie segmentów zbliżonych do prostokąta.

Znaczenie mikroskopii fluorescencyjnej

Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wybiórczą obserwację wybranych komórek i struktur komórkowych, które uprzednio selektywnie zabarwiono znacznikami fluorescencyjnymi. Dzięki temu znalazła szerokie zastosowanie w badaniach nad lokalizacją w komórce tych składników, które są niewidoczne w zwykłym mikroskopie świetlnym, np. białek wirusowych.

Mikroskopy elektronowe

W mikroskopii elektronowej powiększony obraz obserwowanego preparatu otrzymywany jest dzięki zastosowaniu wiązki precyzyjnie emitowanych elektronów. Istnieją dwa główne typy mikroskopów tego typu: transmisyjny mikroskop elektronowy (ang. transmission electron microscope, TEM) oraz skaningowy mikroskop elektronowy (ang. scanning electron microscope, SEM).

Transmisyjny mikroskop elektronowy

W transmisyjnym mikroskopie elektronowym obraz powstaje w wyniku przejścia wiązki elektronów przez bardzo cienki preparat. Warunkiem uzyskania obrazu jest wcześniejsze wyznakowanie obiektu solami metali ciężkich (np. uranu, ołowiu), które wybiórczo wiążą się z różnymi elementami komórki rozpraszając elektrony. Rozproszone elektrony zbierane są przez detektor, tworząc dwuwymiarowy i czarno‑biały obraz.

Transmisyjny mikroskop elektronowy umożliwia uzyskanie powiększenia obrazu do 3 000 000 razy, przy zdolności rozdzielczej na poziomie 0,0002 µm.

RYkW97u27XT3Y

Fotografia spod transmisyjnego mikroskopu elektronowego w powiększeniu trzy tysiące razy przedstawia przekrój podłużny przez mięsień sercowy, z widoczną strukturą sarkomeru. Na zdjęciu widać szare, regularne struktury położone jedne koło drugiej. Są one w podłużne prążki. Struktury oddzielają czarne, podłużne linie, a gdzieniegdzie między nimi znajdują się jasne punkty.

Skaningowy mikroskop elektronowy

W skaningowym mikroskopie elektronowym elektrony nie przechodzą przez preparat, ale odbijają się od jego powierzchni tworząc przy pomocy detektora trójwymiarowy i czarno‑biały obraz jego powierzchni. Warunkiem uzyskania obrazu w SEM, jest wcześniejsze pokrycie badanego obiektu cienką warstwą metalu szlachetnegometale szlachetnemetalu szlachetnego, np. platyny lub złota.

Współczesne mikroskopy skaningowe mogą powiększać obraz do 1 000 000 razy, przy przeciętnej zdolności rozdzielczej ok. 0,001 µm.

RKZH7B6FSK22B

Fotografia zrobiona techniką skaningowej mikrografii elektronowej w powiększeniu stukrotnym przedstawia kwiat rzodkiewnika pospolitego. Obraz jest komputerowo koloryzowany. Części kwiatu w jego wnętrzu mają kolor fioletowy, brązowy, brunatny, żółty i zielony. Na szczycie brązowych pręcików widoczne są żółte, okrągłe pylniki. Niektóre są otwarte, co odsłoniło ziarna pyłku gotowe do rozproszenia. Na szczycie położonego w centrum znamienia słupka widoczne są niebieskie, strzępiaste struktury.

Znaczenie mikroskopii elektronowej

Podsumowanie

• Mikroskop świetlny umożliwia obserwację żywych komórek i podstawowych struktur komórkowych. Powiększa do 1 500 razy, a jego maksymalna zdolność rozdzielcza to 0,2 µm. Mikroskop świetny zbudowany jest z części mechanicznych i optycznych. Obraz widziany z okularze mikroskopu świetlnego jest powiększony, rzeczywisty i odwrócony.

• Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje światło widzialne, ultrafioletowe i podczerwone. Pozwala na obserwację wybranych elementów komórki dzięki barwnikom fluorescencyjnym – umożliwia to precyzyjne wykrywanie określonych białek lub organelli. Powiększenie i zdolność rozdzielcza są takie same jak w mikroskopie świetlnym.

• Mikroskopy elektronowe – TEM (transmisyjny) i SEM (skaningowy) wykorzystują wiązkę elektronów do uzyskiwania obrazów badanych obiektów.

• TEM pozwala zobaczyć szczegółową budowę wewnętrzną komórki i jej organelli. Umożliwia uzyskanie powiększenia obrazu do 3 000 000 razy, przy zdolności rozdzielczej na poziomie 0,0002 µm.

• SEM dostarcza trójwymiarowych obrazów powierzchni badanych struktur. Powiększa obraz do 1 000 000 razy, przy przeciętnej zdolności rozdzielczej ok. 0,001 µm.

• Każdy z mikroskopów ma swoje ograniczenia i zalety, a ich wybór do badań zależy od celu obserwacji.

Ćwiczenia utrwalające

Ćwiczenie 2

RmOFef9zWgwKp

Na ilustracji widać organizm jednokomórkowy w kształcie gruszki. Z jego cieńszego końca wychodzą dwie wici. Organizm ten to obiekt obserwowany pod mikroskopem. Jego wici skierowane są do góry. Poniżej w rzędzie znajdują się cztery identyczne organizmy, które różnią się tylko ułożeniem. Literą A oznaczony jest organizm, którego wici również skierowane są do góry. Literą B organizm, której wici skierowane są w prawo, literą C organizm, którego wici skierowane są w dół, a literą D organizm, którego wici skierowane są w lewo. Należy wskazać ten organizm, który będzie widoczny pod mikroskopem.

RUnfgkOwQQhKc

Wskaż obraz, który widzimy, obserwując obiekt przy użyciu mikroskopu optycznego. Możliwe odpowiedzi: 1. Prawidłowa odpowiedź, 2. Nieprawidłowa odpowiedź A, 3. Nieprawidłowa odpowiedź B