bg‑cyan

Wektory genetyczne

Wektory genetycznewektor genetycznyWektory genetyczne stanowią podstawowe narzędzie klonowania DNA. Najczęściej są one kolistymi cząsteczkami DNA mającymi zdolność do samodzielnej replikacji w cytoplazmie gospodarza.

Wektory genetyczne wykazują istotne cechy:

  • zawierają miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjneenzymy restrykcyjneendonukleazy restrykcyjne;

  • zawierają marker selekcyjnymarker selekcyjnymarker selekcyjny, za pomocą którego można je zidentyfikować, np. geny oporności na antybiotyki;

  • nie są zdolne do przeżycia poza komórką gospodarza;

  • można je łatwo izolować z komórek gospodarza.

Ważne!

Wektory genetyczne, ze względów etycznych, nie powinny mieć genów, które mogą stanowić zagrożenie ekologiczne.

Klonowanie DNA można podzielić na dwa etapy:

  1. otrzymanie zrekombinowanego DNA poprzez wyizolowanie określonego genu od genomu i przeniesienie go do wektora;

  2. wprowadzenie wektora ze wstawionym genem do wybranej komórki i powielenie go na skutek replikacji.

Więcej informacji na temat klonowania DNA znajdziesz w e‑materiale: Klonowanie DNA.

bg‑cyan

Rodzaje wektorów genetycznych

Obecnie jako wektory genetyczne wykorzystuje się wektory plazmidowekosmidykosmidykosmidy, wektory fagowe, sztuczny chromosom bakteryjny, a także pochodne wirusów, wektory drożdżowe oraz plazmid Tiplazmid Tiplazmid Ti.

Wybór wektora zależy od długości klonowanego DNA oraz organizmu, do którego ma on zostać wprowadzony.

R1Z0xYJyYu5nE1
Mapa myśli. Lista elementów:
  • Nazwa kategorii: Wektory genetyczne
    • Elementy należące do kategorii Wektory genetyczne
    • Nazwa kategorii: Wektory[br] prokariotyczne
      • Elementy należące do kategorii Wektory[br] prokariotyczne
      • Nazwa kategorii: Wektory[br] plazmidowe
      • Nazwa kategorii: Kosmidy
      • Nazwa kategorii: Wektory fagowe
      • Nazwa kategorii: Sztuczny [br]chromosom [br]bakteryjny[br](BAC)
      • Koniec elementów należących do kategorii Wektory[br] prokariotyczne
    • Nazwa kategorii: Wektory [br]eukariotyczne
      • Elementy należące do kategorii Wektory [br]eukariotyczne
      • Nazwa kategorii: Wektory –[br] pochodne [br] wirusów
      • Nazwa kategorii: Wektory[br] drożdżowe
      • Nazwa kategorii: Sztuczny [br]chromosom [br]ludzki[br](HAC)
      • Nazwa kategorii: Plazmid Ti
      • Koniec elementów należących do kategorii Wektory [br]eukariotyczne
      Koniec elementów należących do kategorii Wektory genetyczne
Rodzaje wektorów genetycznych.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
Zapamiętaj!

Proces wprowadzania obcego DNA do komórek bakterii nosi nazwę transformacjitransformacjatransformacji, natomiast do komórek eukariotycznych – transfekcjitransfekcjatransfekcji.

bg‑gray3

Wektory prokariotyczne

bg‑pink

Wektory plazmidowe

Plazmidy to kowalentnie zamknięte koliste cząsteczki DNA, które występują u bakterii. Wykorzystywane do klonowania plazmidy są konstruowane z fragmentów naturalnych plazmidów bakteryjnych.

Wektor plazmidowy musi zawierać:

  • miejsce inicjacji replikacji DNA (orioriori), które pozwala na niezależną replikację plazmidu w komórkach; proces niezależnego namnażania wektora zachodzi tylko z udziałem polimerazy i innych niezbędnych do tego składników znajdujących się w komórce biorcy;

  • marker selekcyjny, najczęściej gen oporności na antybiotyk, który pozwoli transformantom rozwijać się na pożywce z antybiotykami;

  • polilinkerpolilinker, miejsce wielokrotnego klonowania, MSCpolilinker, czyli miejsce wielokrotnego klonowania (MSC), którego sekwencje rozpoznawane są przez enzymy restrykcyjne; dzięki temu można wstawiać w taki wektor odcinki klonowanego DNA pozyskane przez trawienie odpowiednimi enzymami;

  • sekwencję promotorową warunkującą ekspresję genów.

Do niektórych wektorów wprowadza się sekwencję, która pozwala na łatwą identyfikację zrekombinowanych bakterii. Zwykle jest to gen kodujący enzym rozkładający barwny substrat, np. gen beta‑galaktozydazy (lacZ).

R14zNdYz4mPNL1
Przykładowy wektor plazmidowy pUC19, mający długość 2686 par zasad (pz). Zaznaczono miejsca restrykcyjne dla niektórych endonukleaz.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
Zapamiętaj!

Jednym z pierwszych najlepiej poznanych i często wykorzystywanych wektorów bakteryjnych był plazmid pBR322, który został skonstruowany w 1976 r. przez Francisco Bolívara i Raymonda Rodrigueza (stąd oznaczenie „BR”). Zawiera on miejsce MCS, pozwalające na replikację w jedynym gospodarzu E. coli, oraz dwa geny oporności: na ampicylinę i tetracyklinę.

Jednym z pierwszych najlepiej poznanych i często wykorzystywanych wektorów bakteryjnych był plazmid p małe B duże R duże 322, który został skonstruowany w 1976 r. przez Francisco BolívaraRaymonda Rodrigueza (stąd oznaczenie „BR”). Zawiera on miejsce MCS, pozwalające na replikację w jedynym gospodarzu E. coli, oraz dwa geny oporności: na ampicylinę i tetracyklinę.

Plazmid pBR322 stał się prekursorem wielu nowszych, coraz doskonalszych wektorów. Udoskonalone zostały m.in. metody selekcji klonów zawierających zrekombinowany DNA, dodano nowe miejsca umożliwiające klonowanie (MCS), zwiększono liczbę kopii plazmidów w komórce oraz skonstruowano wektory wielofunkcyjne, służące do szczegółowej analizy genów.

Klonowanie DNA z wykorzystaniem wektora plazmidowego dzieli się na następujące etapy:

  1. Konstrukcja zrekombinowanej cząsteczki DNA. Proces wprowadzania DNA do wektora rozpoczyna się od wycięcia odpowiedniego fragmentu DNA od innego organizmu lub zsyntetyzowania cząsteczki DNA metodami laboratoryjnymi. W celu fragmentacji DNA wykorzystuje się enzymy restrykcyjne. Przecinają one cząsteczki DNA w określonych miejscach, pozostawiając tzw. lepkie końce. Wektor plazmidowy przecina się takimi samymi enzymami restrykcyjnymi. Następnie wytworzone poza organizmem DNA wprowadza się do przeciętego plazmidu (wektora). Przyłączanie fragmentów DNA z wektorami katalizowane jest przez ligazęligazaligazę DNA, która umożliwia tworzenie się wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcowymi nukleotydami.

  2. Przeniesienie zrekombinowanego plazmidu do komórki bakteryjnej, namnożenie cząsteczek plazmidowego DNA w wyniku podziału komórki i powstania wielu kolonii bakteryjnych ze zrekombinowanym DNA, selekcja zrekombinowanych klonów, amplifikacja oraz oczyszczenie zrekombinowanego plazmidowego DNA.

RD06EaUFfRTdc1
Klonowanie DNA z użyciem plazmidu.
Źródło: Englishsquare Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
bg‑pink

Kosmidy

Zmodyfikowane plazmidy, będące połączeniem cech plazmidów i faga (bakteriofaga) lambda (lambda), nazywane są kosmidami. Umożliwiają one klonowanie dłuższych (10–40 kpzkpz (kilo par zasad)kpz) cząsteczek DNA osłoniętych białkową otoczką.

Typowe kosmidy zawierają sekwencje cossekwencje cossekwencje cos z faga lambda, miejsce inicjacji replikacji plazmidu i gen oporności na antybiotyk. Sekwencja cos umożliwia pakowanie DNA faga do otoczki białkowej i transformację bakterii. Plazmidowe miejsce inicjacji replikacji i gen markerowy umożliwiają namnażanie wektora.

Połączenie cech plazmidu i faga lambda pozwoliło na uzyskanie dużej pojemności i wydajnej transformacji.

bg‑pink

Wektory fagowe

Wektory fagowe wykorzystują naturalne właściwości wirusów do wbudowywania własnego materiału genetycznego w genom zainfekowanej komórki. Przed zastosowaniem tego wektora należy go najpierw pozbawić infekcyjności. Cechuje się on małą pojemnością, natomiast wprowadzony z jego pomocą gen może ulegać ekspresji przez dłuższy czas.

Spośród wektorów fagowych najszersze zastosowanie ma fag lambda.

bg‑pink

Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC)

W celu klonowania długich fragmentów DNA (100–300 kpz) w komórkach prokariotycznych stworzono sztuczny chromosom bakteryjny  BACBACBAC.

BAC to typowy wektor molekularny, który zawiera jedynie fragmenty bakteryjnego chromosomu – kolista cząsteczka pozbawiona sekwencji telomerowych, centromerowych oraz sekwencji replikujących się autonomicznie. Zawiera DNA bakteryjnego czynnika F, warunkującego replikację całego konstruktu w komórkach pałeczki okrężnicy (Escherichia coli).

BAC jest stosowany przy mapowaniu i sekwencjonowaniu genów eukariotycznych. Z jego pomocą skompletowano m.in. mapy fizyczne chromosomów Drosopchila melanogaster. W formie liniowej może on również służyć jako nośnik do integracyjnej transformacji genetycznej zwierząt.

bg‑gray3

Wektory eukariotyczne

bg‑pink

Wektory – pochodne wirusów

Pochodne niektórych wirusów stosuje się jako wektory do wprowadzania DNA do komórek zwierzęcych i roślinnych.

W przypadku komórek zwierzęcych są to pochodne wirusów:

Pierwszym stosowanym wektorem dla komórek zwierzęcych był wirus SV40, którego zaletą jest wysoka wydajność uzyskiwania zrekombinowanego genu, a wadą – ograniczona długość wbudowanego DNA.

Aktualnie coraz częściej jako wektory wirusowe wykorzystywane są retrowirusy, których materiałem genetycznym jest RNA. Informacja genetyczna zapisana w ich genomie przepisywana jest za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy na DNA, a następnie wbudowywana do genomu gospodarza. Retrowirusy zakażają komórki ulegające podziałom, jednak niektóre z nich – lentiwirusy – mogą włączać swój materiał genetyczny również w komórkach niedzielących się.

Ważne!

Pozyskiwanie cząsteczek DNA można przeprowadzić za pomocą syntezy enzymatycznej, czyli przy użyciu matrycy RNA i enzymu odwrotnej transkryptazy lub techniki PCRreakcja łańcuchowa polimerazy, PCRPCR.

bg‑pink

Wektory drożdżowe

Typowy wektor drożdżowy skonstruowany jest z dwóch części:

  • części prokariotycznej, która zawiera miejsce ori i marker selekcyjny;

  • części eukariotycznej, która zawiera miejsce ori rozpoznawane przez polimerazę eukariotycznego gospodarza, marker selekcyjny oraz sekwencje umożliwiające ekspresję genu.

Konstrukcja ta pozwala na klonowanie genów w Escherichia coli i badanie ich ekspresji w drożdżach.

Do wektorów drożdżowych należy sztuczny chromosom drożdżowy  YACYACYAC, który umożliwił klonowanie bardzo długich (do 5 mln pzpzpz) fragmentów DNA w komórkach eukariotycznych (drożdży).

bg‑pink

Sztuczny chromosom ludzki

Powodzenie w skonstruowaniu YAC przyczyniło się do podjęcia prac nad stworzeniem sztucznego chromosomu ludzkiego  HACHACHAC. Przewiduje się jego wykorzystanie w terapiach genowych. Wszystkie sztuczne chromosomy podczas podziałów mitotycznych zachowują się jak zwyczajne chromosomy.

bg‑pink

Plazmid Ti

Szczególnym przykładem plazmidu wykorzystywanego w inżynierii genetycznej jest plazmid Ti pochodzący z bakterii Agrobacterium tumefaciens. Ma on zdolność do skutecznego włączania przenoszonego fragmentu DNA do genomu gospodarza, dlatego wykorzystywany jest do modyfikacji genetycznych roślin.

bg‑cyan

Zastosowanie wektorów genetycznych

Wektory genetyczne znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle biotechnologicznym, medycynie genetycznej, biologii molekularnej, biologii komórkowej i biochemii. Przede wszystkim wykorzystywane są do klonowania DNA, z kolei sklonowane fragmenty DNA mogą być używane do izolacji i analizy genów, odczytywania ich sekwencji nukleotydowej oraz wyszukania mutacji odpowiadających za dane choroby. Pozwalają też na tworzenie bibliotek genowych różnych organizmów.

Ponadto wektory genetyczne wykorzystywane są do przenoszenia genów pomiędzy organizmami. Te, które umożliwiają przenoszenie DNA pomiędzy różnymi gatunkami, nazywane są wektorami wahadłowymi. Taki system pozwala na dostarczanie do komórek eukariotycznych DNA lub białka, które indukują komórkową odpowiedź immunologiczną organizmu.

Wektory genetyczne mogą być również stosowane w produkcji białek. Pierwszym białkiem ssaczym stworzonym przy użyciu technik rekombinacji DNA była ludzka insulina – lek, który uratował życie milionom osób chorych na cukrzycę.

Wektory genetyczne wykorzystuje się także do produkcji szczepionek nowej generacji. Są one wysoce efektywne i bezpieczne dla pacjenta. Więcej informacji na ich temat znajdziesz w e‑materiale pt. Szczepionki nowej generacjiPvCHrIQVhSzczepionki nowej generacji.

Słownik

adenowirusy
adenowirusy

rodzina kulistych wielościennych wirusów o genomie zbudowanym z dwuniciowego DNA; występują w drogach oddechowych i układzie pokarmowym większości ludzi; adenowirusy są chorobotwórcze dla człowieka, niektórych ssaków oraz ptaków

BAC
BAC

(ang. bacterial artificial chromosome) sztuczny chromosom bakteryjny

bakulowirusy
bakulowirusy

rodzina wirusów DNA chorobotwórczych dla stawonogów, głównie owadów; mają genom w postaci kolistego dwuniciowego DNA; otoczone osłonką wiriony mają kształt prętów i zawierają jeden lub więcej nukleokapsydów; dzielą się na trzy grupy w zależności od wyglądu ciał białkowych, które mogą być krystaliczne, wielościenne lub pałeczkowate; wykorzystywane są do walki z owadami szkodliwymi oraz jako wektory w biotechnologii

enzymy restrykcyjne
enzymy restrykcyjne

restryktazy, endonukleazy restrykcyjne; enzymy przecinające nić DNA w wyznaczonym miejscu przez specyficzną sekwencję DNA

HAC
HAC

(ang. human artificial chromosome) sztuczny chromosom ludzki

kosmidy
kosmidy

plazmidy zawierające sekwencję cos – sekwencję odpowiedzialną za „pakowanie” DNA w kapsyd wirusa – co umożliwia zapakowanie rekombinacyjnych kosmidów w układzie in vitro w kapsydy bakteriofaga lambda

kpz (kilo par zasad)
kpz (kilo par zasad)

odcinek DNA złożony z tysiąca par zasad (pz)

ligaza
ligaza

enzym katalizujący powstawanie wiązań chemicznych pomiędzy dwoma fragmentami DNA

marker selekcyjny
marker selekcyjny

gen, którego obecność można łatwo zidentyfikować

ori
ori

(od ang. origin – początek) charakterystyczna sekwencja nukleotydów w DNA lub RNA będąca miejscem inicjacji replikacji

papillomawirusy
papillomawirusy

rodzina wirusów, których materiałem genetycznym jest kolista cząsteczka DNA; wirusy te nie mają otoczki lipidowej; np. wirus brodawczaka ludzkiego (HPV)

plazmid Ti
plazmid Ti

(ang. tumor‑inducing plazmid) plazmid bakterii Agrobacterium tumefaciens; często wykorzystywany jako wektor w inżynierii genetycznej roślin

polilinker, miejsce wielokrotnego klonowania, MSC
polilinker, miejsce wielokrotnego klonowania, MSC

(ang. multiple cloning site) odcinek DNA wektora genetycznego, w którym znajdują się liczne sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne

pz
pz

para zasad; połączone wiązaniami wodorowymi dwie komplementarne zasady azotowe nukleotydów dwóch różnych nici DNA

sekwencje cos
sekwencje cos

występują na końcach genomu faga lambda; stanowią tzw. końce kohezyjne, które umożliwiają powstawanie formy kolistej DNA

retrowirusy
retrowirusy

rodzina wirusów wykorzystujących w procesie replikacji DNA enzym RNA‑zależną polimerazę DNA (odwrotną transkryptazę); swą nazwę zawdzięczają specyficznemu sposobowi syntezy kwasu nukleinowego, rozpoczynającej się od przepisania informacji z RNA na DNA; retrowirusy są szeroko rozpowszechnionymi czynnikami zakaźnymi kręgowców, wywołującymi choroby nowotworowe tkanek pochodzenia mezodermalnego (białaczki, chłoniaki, mięsaki) i nabłonkowego (np. rak sutka, nerek, wątroby), niedobory immunologiczne, choroby autoagresyjne

reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR
reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR

(ang. polymerase chain reaction) technika laboratoryjna biologii molekularnej pozwalająca na powielanie wybranego odcinka DNA in vitro

SV40
SV40

(ang. Simian virus 40) wirus należący do rodziny poliomawirusów; jest odporny na działanie formaliny, która była używana do produkcji szczepionek przeciwko polio

transfekcja
transfekcja

wprowadzenie do komórek eukariotycznych obcego DNA przez wytworzenie porów w błonie komórkowej za pomocą prądu elektrycznego, bombardowanie komórek kulkami ze złota lub wolframu opłaszczonymi DNA bądź wstrzykiwanie obcego DNA za pomocą cienkich kapilar

transformacja
transformacja

zmiana cech dziedzicznych danego szczepu bakterii pod wpływem pobranego z otoczenia DNA

wektor genetyczny
wektor genetyczny

cząsteczki lub organizmy zdolne do przeniesienia informacji genetycznej do organizmu biorcy

wirus krowianki
wirus krowianki

wirus wywołujący zakaźną chorobę bydła domowego i świń; może być patogenny dla człowieka

YAC
YAC

(ang. yeast artificial chromosomes) sztuczny chromosom drożdżowy