Wektory genetycznewektor genetycznyWektory genetyczne stanowią podstawowe narzędzie klonowania DNA. Najczęściej są one kolistymi cząsteczkami DNA mającymi zdolność do samodzielnej replikacji w cytoplazmie gospodarza.

Wektory genetyczne wykazują istotne cechy:

• zawierają miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjneenzymy restrykcyjneendonukleazy restrykcyjne;

• zawierają marker selekcyjnymarker selekcyjnymarker selekcyjny, za pomocą którego można je zidentyfikować, np. geny oporności na antybiotyki;

• nie są zdolne do przeżycia poza komórką gospodarza;

• można je łatwo izolować z komórek gospodarza.

Klonowanie DNA można podzielić na dwa etapy:

1. otrzymanie zrekombinowanego DNA poprzez wyizolowanie określonego genu od genomu i przeniesienie go do wektora;

2. wprowadzenie wektora ze wstawionym genem do wybranej komórki i powielenie go na skutek replikacji.

Więcej informacji na temat klonowania DNA znajdziesz w e‑materiale: Klonowanie DNA.

Obecnie jako wektory genetyczne wykorzystuje się wektory plazmidowe, kosmidykosmidykosmidy, wektory fagowe, sztuczny chromosom bakteryjny, a także pochodne wirusów, wektory drożdżowe oraz plazmid Tiplazmid Tiplazmid Ti.

Wybór wektora zależy od długości klonowanego DNA oraz organizmu, do którego ma on zostać wprowadzony.

Plazmidy to kowalentnie zamknięte koliste cząsteczki DNA, które występują u bakterii. Wykorzystywane do klonowania plazmidy są konstruowane z fragmentów naturalnych plazmidów bakteryjnych.

Wektor plazmidowy musi zawierać:

• miejsce inicjacji replikacji DNA (orioriori), które pozwala na niezależną replikację plazmidu w komórkach; proces niezależnego namnażania wektora zachodzi tylko z udziałem polimerazy i innych niezbędnych do tego składników znajdujących się w komórce biorcy;

• marker selekcyjny, najczęściej gen oporności na antybiotyk, który pozwoli transformantom rozwijać się na pożywce z antybiotykami;

• polilinkerpolilinker, miejsce wielokrotnego klonowania, MSCpolilinker, czyli miejsce wielokrotnego klonowania (MSC), którego sekwencje rozpoznawane są przez enzymy restrykcyjne; dzięki temu można wstawiać w taki wektor odcinki klonowanego DNA pozyskane przez trawienie odpowiednimi enzymami;

• sekwencję promotorową warunkującą ekspresję genów.

Do niektórych wektorów wprowadza się sekwencję, która pozwala na łatwą identyfikację zrekombinowanych bakterii. Zwykle jest to gen kodujący enzym rozkładający barwny substrat, np. gen beta‑galaktozydazy (lacZ).

Klonowanie DNA z wykorzystaniem wektora plazmidowego dzieli się na następujące etapy:

1. Konstrukcja zrekombinowanej cząsteczki DNA. Proces wprowadzania DNA do wektora rozpoczyna się od wycięcia odpowiedniego fragmentu DNA od innego organizmu lub zsyntetyzowania cząsteczki DNA metodami laboratoryjnymi. W celu fragmentacji DNA wykorzystuje się enzymy restrykcyjne. Przecinają one cząsteczki DNA w określonych miejscach, pozostawiając tzw. lepkie końce. Wektor plazmidowy przecina się takimi samymi enzymami restrykcyjnymi. Następnie wytworzone poza organizmem DNA wprowadza się do przeciętego plazmidu (wektora). Przyłączanie fragmentów DNA z wektorami katalizowane jest przez ligazęligazaligazę DNA, która umożliwia tworzenie się wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcowymi nukleotydami.

2. Przeniesienie zrekombinowanego plazmidu do komórki bakteryjnej, namnożenie cząsteczek plazmidowego DNA w wyniku podziału komórki i powstania wielu kolonii bakteryjnych ze zrekombinowanym DNA, selekcja zrekombinowanych klonów, amplifikacja oraz oczyszczenie zrekombinowanego plazmidowego DNA.

Zmodyfikowane plazmidy, będące połączeniem cech plazmidów i faga (bakteriofaga) lambda (λlambda), nazywane są kosmidami. Umożliwiają one klonowanie dłuższych (10–40 kpzkpz (kilo par zasad)kpz) cząsteczek DNA osłoniętych białkową otoczką.

Typowe kosmidy zawierają sekwencje cossekwencje cossekwencje cos z faga lambda, miejsce inicjacji replikacji plazmidu i gen oporności na antybiotyk. Sekwencja cos umożliwia pakowanie DNA faga do otoczki białkowej i transformację bakterii. Plazmidowe miejsce inicjacji replikacji i gen markerowy umożliwiają namnażanie wektora.

Połączenie cech plazmidu i faga lambda pozwoliło na uzyskanie dużej pojemności i wydajnej transformacji.

Wektory fagowe wykorzystują naturalne właściwości wirusów do wbudowywania własnego materiału genetycznego w genom zainfekowanej komórki. Przed zastosowaniem tego wektora należy go najpierw pozbawić infekcyjności. Cechuje się on małą pojemnością, natomiast wprowadzony z jego pomocą gen może ulegać ekspresji przez dłuższy czas.

Spośród wektorów fagowych najszersze zastosowanie ma fag lambda.

W celu klonowania długich fragmentów DNA (100–300 kpz) w komórkach prokariotycznych stworzono sztuczny chromosom bakteryjny – BACBACBAC.

BAC to typowy wektor molekularny, który zawiera jedynie fragmenty bakteryjnego chromosomu – kolista cząsteczka pozbawiona sekwencji telomerowych, centromerowych oraz sekwencji replikujących się autonomicznie. Zawiera DNA bakteryjnego czynnika F, warunkującego replikację całego konstruktu w komórkach pałeczki okrężnicy (Escherichia coli).

BAC jest stosowany przy mapowaniu i sekwencjonowaniu genów eukariotycznych. Z jego pomocą skompletowano m.in. mapy fizyczne chromosomów Drosopchila melanogaster. W formie liniowej może on również służyć jako nośnik do integracyjnej transformacji genetycznej zwierząt.

Pochodne niektórych wirusów stosuje się jako wektory do wprowadzania DNA do komórek zwierzęcych i roślinnych.

W przypadku komórek zwierzęcych są to pochodne wirusów:

• SV40SV40SV40;

• PapillomapapillomawirusyPapilloma;

• krowiankiwirus krowiankikrowianki;

• bakulowirusówbakulowirusybakulowirusów;

• adenowirusówadenowirusyadenowirusów;

• retrowirusówretrowirusyretrowirusów.

Pierwszym stosowanym wektorem dla komórek zwierzęcych był wirus SV40, którego zaletą jest wysoka wydajność uzyskiwania zrekombinowanego genu, a wadą – ograniczona długość wbudowanego DNA.

Aktualnie coraz częściej jako wektory wirusowe wykorzystywane są retrowirusy, których materiałem genetycznym jest RNA. Informacja genetyczna zapisana w ich genomie przepisywana jest za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy na DNA, a następnie wbudowywana do genomu gospodarza. Retrowirusy zakażają komórki ulegające podziałom, jednak niektóre z nich – lentiwirusy – mogą włączać swój materiał genetyczny również w komórkach niedzielących się.

Typowy wektor drożdżowy skonstruowany jest z dwóch części:

• części prokariotycznej, która zawiera miejsce ori i marker selekcyjny;

• części eukariotycznej, która zawiera miejsce ori rozpoznawane przez polimerazę eukariotycznego gospodarza, marker selekcyjny oraz sekwencje umożliwiające ekspresję genu.

Konstrukcja ta pozwala na klonowanie genów w Escherichia coli i badanie ich ekspresji w drożdżach.

Do wektorów drożdżowych należy sztuczny chromosom drożdżowy – YACYACYAC, który umożliwił klonowanie bardzo długich (do 5 mln pzpzpz) fragmentów DNA w komórkach eukariotycznych (drożdży).

Powodzenie w skonstruowaniu YAC przyczyniło się do podjęcia prac nad stworzeniem sztucznego chromosomu ludzkiego – HACHACHAC. Przewiduje się jego wykorzystanie w terapiach genowych. Wszystkie sztuczne chromosomy podczas podziałów mitotycznych zachowują się jak zwyczajne chromosomy.

Szczególnym przykładem plazmidu wykorzystywanego w inżynierii genetycznej jest plazmid Ti pochodzący z bakterii Agrobacterium tumefaciens. Ma on zdolność do skutecznego włączania przenoszonego fragmentu DNA do genomu gospodarza, dlatego wykorzystywany jest do modyfikacji genetycznych roślin.

Wektory genetyczne znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle biotechnologicznym, medycynie genetycznej, biologii molekularnej, biologii komórkowej i biochemii. Przede wszystkim wykorzystywane są do klonowania DNA, z kolei sklonowane fragmenty DNA mogą być używane do izolacji i analizy genów, odczytywania ich sekwencji nukleotydowej oraz wyszukania mutacji odpowiadających za dane choroby. Pozwalają też na tworzenie bibliotek genowych różnych organizmów.

Ponadto wektory genetyczne wykorzystywane są do przenoszenia genów pomiędzy organizmami. Te, które umożliwiają przenoszenie DNA pomiędzy różnymi gatunkami, nazywane są wektorami wahadłowymi. Taki system pozwala na dostarczanie do komórek eukariotycznych DNA lub białka, które indukują komórkową odpowiedź immunologiczną organizmu.

Wektory genetyczne mogą być również stosowane w produkcji białek. Pierwszym białkiem ssaczym stworzonym przy użyciu technik rekombinacji DNA była ludzka insulina – lek, który uratował życie milionom osób chorych na cukrzycę.

Wektory genetyczne wykorzystuje się także do produkcji szczepionek nowej generacji. Są one wysoce efektywne i bezpieczne dla pacjenta. Więcej informacji na ich temat znajdziesz w e‑materiale pt. Szczepionki nowej generacjiPvCHrIQVhSzczepionki nowej generacji.

Słownik