Mikroskop pozwala na powiększenie obrazu obiektu, którego nie możemy obserwować gołym okiem. Do najczęściej stosowanych mikroskopów zalicza się: mikroskopy optyczne (świetlne), mikroskopy fluorescencyjne oraz mikroskopy elektronowe.

Istnieją różne rodzaje mikroskopów świetlnych. Wszystkie działają według tej samej zasady: wymagają światła do obserwacji materiału biologicznego. Choć źródło światła może być naturalne (światło słoneczne), obecnie częściej stosuje się sztuczne światło z zainstalowanej w mikroskopie żarówki lub diody. Wiele z promieni świetlnych, które padają na preparatpreparat mikroskopowypreparat zawierający materiał biologiczny, ulega częściowemu odbiciu lub pochłonięciu, ale pozostałe przenikają przez obserwowany obiekt.

Promienie świetlne docierają do układu optycznego, utworzonego z kilku soczewek umieszczonych w obiektywie i okularze. Soczewki te powiększają obraz obserwowanego przedmiotu. Niektóre elementy układu optycznego są ruchome, dzięki czemu użytkownik może właściwie zogniskować powstały obraz, by był ostry i wyraźny.

Zaawansowane mikroskopy optyczne pozwalają na uzyskanie nawet 1500‑krotnego powiększenia, przy maksymalnej rozdzielczości na poziomie 0,2 µm. Takie parametry umożliwiają obserwację większości komórek zwierzęcych i roślinnych oraz komórek bakterii. Możliwa jest także obserwacja niektórych organelli komórki eukariotycznej.

Mikroskopia optyczna jest niezwykle użyteczna w badaniach biologicznych. Umożliwia zaobserwowanie ruchu komórek (np. bakterii) lub procesów fizjologicznych, które zachodzą w żywych komórkach (np. podziały komórkowe). W mikroskopii optycznej wykorzystuje się również preparaty z martwych komórek, po odpowiednim utrwaleniu, a czasem też wybarwieniu.

Odmianą mikroskopu świetlnego jest mikroskop fluorescencyjnyfluorescencjafluorescencyjny, który również wymaga źródła światła oraz układu optycznego. Występują w nim jednak dodatkowe elementy: filtr światła wzbudzającego i filtr światła emitowanego. Pierwszy z nich przepuszcza przez obiektyw (do preparatu) światło o pożądanej długości fali, drugi natomiast przepuszcza do okularu światło emitowane przez  preparat fluorescencyjny po jego przejściu przez obiektyw.

W mikroskopii fluorescencyjnej preparaty poddaje się uprzedniemu znakowaniu odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym, zawierającym fluorochromfluorochrom (fluorofor)fluorochrom. Dzięki obecności regulowanego filtra na preparat nakierowuje się światło o właściwej długości fali, aby wzbudzić fluorochrom do emisji światła o większej długości fali. Powstałe światło (tzw. światło emitowane) ulega następnie filtrowaniu i przez elementy optyczne dociera do ludzkiego oka lub kamery. Tak powstaje powiększony obraz, który wygląda jak negatyw obrazu z konwencjonalnego mikroskopu optycznego – struktury są widoczne w kolorze, na ciemnym tle.

Mikroskop konfokalny

Mikroskop konfokalny to nowoczesny rodzaj mikroskopu fluorescencyjnego, w którym źródłem promieniowania jest wiązka laserowa skanująca preparat.

W mikroskopie konfokalnym, inaczej niż w konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym, obraz powstaje „punkt po punkcie” w wyniku przemieszczania się wiązki lasera po preparacie. Dzięki temu uzyskany obraz charakteryzuje się ostrymi konturami. Ponadto mikroskop konfokalny umożliwia otrzymanie przekrojów badanego obiektu na różnych głębokościach. Obraz mikroskopowy uzyskiwany jest w formie elektronicznej, zatem może być zapisywany i analizowany przez programy sprzężonego z mikroskopem komputera. W ten sposób możliwe jest np. tworzenie trójwymiarowego obrazu badanego obiektu.

RN8BSH7iwk1lS

Fotografia spod mikroskopu fluorescencyjnego przedstawia błonę komórkową drożdży. Jest to układ nieregularnie ułożonych na czarnym tle kolorowych kół. Białka błonowe oznaczone zostały markerami fluorescencyjnymi świecącymi na zielono i czerwono. Nałożenie tych dwóch barw daje na obrazie kolor żółty.

RO9SpdqjZHs06

Zdjęcie wykonane mikroskopem konfokalnym w powiększeniu sześćdziesięciokrotnym przedstawia liść zarodkowy rzodkiewnika pospolitego barwiony jodkiem propidyny na czarnym tle. Ma kolor żółty, owalny kształt, jest podzielony na szereg niewielkich, nieregularnych, przylegających do siebie segmentów zbliżonych do prostokąta.

Ze względu na podobny mechanizm działania, mikroskopy fluorescencyjne pozwalają na takie samo maksymalne powiększenie i taką samą rozdzielczość jak mikroskopy optyczne. Ich wady i zalety są podobne.

W mikroskopii elektronowej powiększony obraz obserwowanego preparatu otrzymywany jest dzięki zastosowaniu wiązki precyzyjnie emitowanych elektronów. Istnieją dwa główne typy mikroskopów tego typu: transmisyjny mikroskop elektronowy (ang. transmission electron microscope, TEM) oraz skaningowy mikroskop elektronowy (ang. scanning electron microscope, SEM).

Działo elektronowe uwalnia elektrony w kierunku katody i anody – elementów budowy mikroskopu niezbędnych do zwiększenia prędkości elektronów, czego skutkiem jest wyższa rozdzielczość obrazu. Ponieważ we wnętrzu mikroskopów elektronowych panuje próżnia, szybkość cząstek może być jeszcze wyższa. Rozpędzone elektrony są następnie skupiane przy użyciu soczewek elektromagnetycznych i trafiają na preparat. We współczesnych mikroskopach elektronowych obraz obserwowanego preparatu podlega detekcji przez komputer i jest wyświetlany na monitorze (jest to tzw. obserwacja pośrednia).

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

Umożliwia uzyskanie powiększenia obrazu 1 000 000 razy, przy zdolności rozdzielczejzdolność rozdzielczazdolności rozdzielczej na poziomie 0,2 nm.

Obraz obserwowanego preparatu w mikroskopii TEM powstaje z elektronów przechodzących przez próbkę. Z tego powodu preparat musi być odpowiednio przygotowany – jego grubość nie powinna przekraczać 1 µm. W przeciwnym przypadku strumień elektronów uległby rozproszeniu, a obraz byłby nieostry i mało kontrastowy. Preparat barwi się związkami metali ciężkich (np. ołowiu, uranu), aby zwiększyć kontrast struktur komórki zróżnicowanych pod względem powinowactwa do jonów tych metali. Uzyskany obraz jest dwuwymiarowy.

Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)

Umożliwia obserwację trójwymiarowej topografii powierzchni przedmiotów powiększonych nawet 4 000 000 razy przy maksymalnej rozdzielczości 1 nm, choć średnia grubość próbki to setki nm.

Trójwymiarowy obraz obserwowanego preparatu powstaje dlatego, że w mikroskopii SEM wiązka elektronów padająca na preparat ulega odbiciu, pochłonięciu lub wzbudza cząstki preparatu. Odbite bądź wzbudzone elektrony trafiają do detektorów mikroskopu, a następnie – przy użyciu komputera – powstaje powiększony obraz trójwymiarowej powierzchni obserwowanego przedmiotu. Aby jak najmniej elektronów padających na preparat ulegało pochłonięciu, w mikroskopii SEM obserwowane przedmioty na całej powierzchni badanej próbki pokrywa się cienką warstwą wybranych metali szlachetnychmetale szlachetnemetali szlachetnych.

Słownik