Klonowanie DNA to proces polegający na namnożeniu (powieleniu) kopii danego fragmentu DNA w komórkach biorcy (gospodarza), zwykle bakterii Escherichia coli, przy zastosowaniu specjalnego nośnika DNA – wektora genetycznego.

Wektor połączony z docelowym fragmentem DNA (najczęściej zawierający konkretny gen lub geny) tworzy cząsteczkę zrekombinowanego DNAzrekombinowana cząsteczka DNAcząsteczkę zrekombinowanego DNA.

Do przeprowadzenia klonowania DNA niezbędne są:

• docelowy fragment DNA zawierający gen, który ma zostać powielony (sklonowany) do komórki;

• wektor genetyczny – służący jako nośnik fragmentu DNA przeznaczonego do sklonowania;

• enzymy restrykcyjne – służące do wycięcia wybranego fragmentu DNA z genomu organizmu, z którego zostanie pobrany, oraz przecięcia wektora, np. plazmidu; enzymy te rozpoznają swoiste sekwencje w dwuniciowej cząsteczce DNA, nazywane miejscami restrykcyjnymi, i przecinają DNA w danym miejscu;

• ligaza – enzym umożliwiający połączenie wyciętego fragmentu DNA z DNA wektora;

• gen reporterowygen reporterowygen reporterowy – znacznik pokazujący, czy procedura się powiodła.

Główne klasy enzymów restrykcyjnych

Enzymy restrykcyjne ze względu na: typ rozpoznawanych sekwencji, sposób rozcinania DNA oraz strukturę enzymu dzieli się na trzy klasy. W klonowaniu DNA stosuje się głównie enzymy klasy II, ponieważ rozcinają cząsteczkę DNA dokładnie w rozpoznawanym miejscu – w przeciwieństwie do enzymów I i III klasy, które rozcinają DNA w innych miejscach niż rozpoznawana sekwencja, co prowadzi do powstania losowego zbioru fragmentów.

Więcej informacji na temat enzymów restrykcyjnych znajdziesz w e‑materiale Enzymy stosowane w biotechnologii molekularnej.

Gen reporterowy

Gen reporterowy to dobrze poznany gen, którego produkty (RNA lub białko) mogą być mierzone dokładnie i w prosty sposób. Monitorując zmiany w poziomie produktu tego genu, można łatwo obserwować zmiany w jego ekspresji.

Najczęściej stosowanymi genami reporterowymi są geny kodujące: beta‑galaktozydazę (beta‑gal) oraz beta‑glukuronidazę (GUS) z bakterii Escherichia coli, lucyferazę (Luc) ze świetlika Photinus pyralis, białko zielonej fluorescencji (GFPGFPGFP) z meduzy Aequorea victoria oraz acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT) z występującego w E. coli transpozonu Tn9.

• Beta‑gal katalizuje hydrolizę beta‑galaktozydów, natomiast GUS hydrolizuje glukuronidy. W wyniku hydrolizy substratów stosowanych w oznaczaniu beta‑gal i GUS powstają produkty, które mogą być mierzone ilościowo za pomocą spektrofotometru.

• Lucyferaza jest enzymem utleniającym lucyferynę, w wyniku czego powstaje fluorescencyjny produkt, którego ilość można oznaczyć przez rejestrację uwolnionego światła.

• GFP to naturalnie fluoryzujące białko, które może być wykrywane bezpośrednio w żywych komórkach.

• Enzym CAT katalizuje acetylację chloramfenikolu, w której donorem grupy acetylowej jest acetylo‑CoA. Acetylowany chloramfenikol można mierzyć m.in. za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub testu immunoenzymatycznego.

Genem reporterowym może być również gen oporności bakterii na określony antybiotyk. Na podłożu z antybiotykiem wyrosną jedynie te bakterie, które pobrały wektor. Gen reporterowy może też powodować pojawienie się jakiejś cechy, np. barwy na skutek wytworzenia barwnika.

Jak duży gen można wprowadzić do wektora?

O wielkości wprowadzonego DNA decyduje pojemność wektora.

Pojemność wektora zależy od jego rodzaju. Do klonowania DNA wykorzystuje się wektory genetyczne zdolne do przeniesienia materiału genetycznego z komórki dawcy do komórki biorcy. Różne rodzaje wektorów służą do klonowania odcinków DNA o różnej wielkości. Wektory dzieli się na:

• prokariotyczne, do których należą wektory plazmidowe, kosmidy, wektory fagowe i sztuczny chromosom bakteryjny;

• eukariotyczne, do których należą pochodne wirusów, wektory drożdżowe, sztuczny chromosom ludzki i plazmid Ti.

Więcej informacji o wektorach znajdziesz w e‑materiale Wektory genetyczne.

Ostatnim etapem klonowania DNA jest selekcja, czyli wyodrębnienie bakterii, które przyjęły zrekombinowany plazmid wraz z genem reporterowym zapewniającym oporność na antybiotyk, od tych, które go nie mają. Po przeprowadzonej transformacji bakterie posiewa się na płytki z podłożem selekcyjnym z antybiotykiem. Bakterie bez plazmidu zginą; te zaś, które zyskały dzięki nowym genom antybiotykooporność, będą rosnąć na pożywkach odżywczych z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku, tworząc małe kolonie. Każda z nich będzie zawierać taki sam zrekombinowany plazmid z klonowanym fragmentem DNA.

Aby się upewnić, że uzyskane kolonie mają plazmid o prawidłowej strukturze, sprawdzane są pod kątem obecności zrekombinowanego genu. W tym celu wykorzystuje się reakcję PCRPCRreakcję PCR przeprowadzaną na wyizolowanych plazmidach z kilku kolonii lub trawienie za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. O obecności klonowanego DNA świadczy uzyskanie fragmentów DNA o określonej długości.

Więcej informacji o reakcji PCR znajdziesz w e‑materiale Łańcuchowa reakcja polimerazy.

Techniki klonowania molekularnego są powszechnie stosowane w badaniach DNA, genów, ich funkcji oraz ekspresji. Dzięki nim możliwe stały się identyfikacja oraz izolacja genów, które są odpowiedzialne za występowanie różnych chorób. Stanowi to podłoże do zastosowania terapii genowej. Co więcej, sama terapia genowa wykorzystuje techniki klonowania DNA poprzez dostarczenie funkcjonalnych fragmentów DNA do komórek pacjentów.

Klonowanie DNA pozwala także na uzyskanie organizmów transgenicznych do produkcji ludzkich białek, np. bakterii produkujących ludzkie hormony wzrostu czy insulinę. Wykorzystywane jest również w produkcji szczepionek, które uzyskuje się poprzez tworzenie odpowiednich białek.

Ponadto klonowanie umożliwia tworzenie bibliotek genomowych i bibliotek cDNA. Więcej informacji na ten temat znajdziesz w e‑materiale Biblioteki genomowe i cDNA.

Słownik