bg‑red

Klonowanie DNA

Klonowanie DNA to proces polegający na namnożeniu (powieleniu) kopii danego fragmentu DNA w komórkach biorcy (gospodarza), zwykle bakterii Escherichia coli, przy zastosowaniu specjalnego nośnika DNA – wektora genetycznego.

Wektor połączony z docelowym fragmentem DNA (najczęściej zawierający konkretny gen lub geny) tworzy cząsteczkę zrekombinowanego DNAzrekombinowana cząsteczka DNAcząsteczkę zrekombinowanego DNA.

R1TSApnbdDqNO1
Schemat powstawania wektora plazmidowego.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.

Do przeprowadzenia klonowania DNA niezbędne są:

  • docelowy fragment DNA zawierający gen, który ma zostać powielony (sklonowany) do komórki;

  • wektor genetyczny – służący jako nośnik fragmentu DNA przeznaczonego do sklonowania;

  • enzymy restrykcyjne – służące do wycięcia wybranego fragmentu DNA z genomu organizmu, z którego zostanie pobrany, oraz przecięcia wektora, np. plazmidu; enzymy te rozpoznają swoiste sekwencje w dwuniciowej cząsteczce DNA, nazywane miejscami restrykcyjnymi, i przecinają DNA w danym miejscu;

  • ligaza – enzym umożliwiający połączenie wyciętego fragmentu DNA z DNA wektora;

  • gen reporterowygen reporterowygen reporterowy – znacznik pokazujący, czy procedura się powiodła.

Główne klasy enzymów restrykcyjnych

Enzymy restrykcyjne ze względu na: typ rozpoznawanych sekwencji, sposób rozcinania DNA oraz strukturę enzymu dzieli się na trzy klasy. W klonowaniu DNA stosuje się głównie enzymy klasy II, ponieważ rozcinają cząsteczkę DNA dokładnie w rozpoznawanym miejscu – w przeciwieństwie do enzymów I i III klasy, które rozcinają DNA w innych miejscach niż rozpoznawana sekwencja, co prowadzi do powstania losowego zbioru fragmentów.

Więcej informacji na temat enzymów restrykcyjnych znajdziesz w e‑materiale Enzymy stosowane w biotechnologii molekularnej.

Gen reporterowy

Gen reporterowy to dobrze poznany gen, którego produkty (RNA lub białko) mogą być mierzone dokładnie i w prosty sposób. Monitorując zmiany w poziomie produktu tego genu, można łatwo obserwować zmiany w jego ekspresji.

Najczęściej stosowanymi genami reporterowymi są geny kodujące: beta‑galaktozydazę (beta‑gal) oraz beta‑glukuronidazę (GUS) z bakterii Escherichia coli, lucyferazę (Luc) ze świetlika Photinus pyralis, białko zielonej fluorescencji (GFPGFPGFP) z meduzy Aequorea victoria oraz acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT) z występującego w E. coli transpozonu Tn9.

  • Beta‑gal katalizuje hydrolizę beta‑galaktozydów, natomiast GUS hydrolizuje glukuronidy. W wyniku hydrolizy substratów stosowanych w oznaczaniu beta‑gal i GUS powstają produkty, które mogą być mierzone ilościowo za pomocą spektrofotometru.

  • Lucyferaza jest enzymem utleniającym lucyferynę, w wyniku czego powstaje fluorescencyjny produkt, którego ilość można oznaczyć przez rejestrację uwolnionego światła.

  • GFP to naturalnie fluoryzujące białko, które może być wykrywane bezpośrednio w żywych komórkach.

  • Enzym CAT katalizuje acetylację chloramfenikolu, w której donorem grupy acetylowej jest acetylo‑CoA. Acetylowany chloramfenikol można mierzyć m.in. za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub testu immunoenzymatycznego.

Genem reporterowym może być również gen oporności bakterii na określony antybiotyk. Na podłożu z antybiotykiem wyrosną jedynie te bakterie, które pobrały wektor. Gen reporterowy może też powodować pojawienie się jakiejś cechy, np. barwy na skutek wytworzenia barwnika.

Jak duży gen można wprowadzić do wektora?

O wielkości wprowadzonego DNA decyduje pojemność wektora.

Pojemność wektora zależy od jego rodzaju. Do klonowania DNA wykorzystuje się wektory genetyczne zdolne do przeniesienia materiału genetycznego z komórki dawcy do komórki biorcy. Różne rodzaje wektorów służą do klonowania odcinków DNA o różnej wielkości. Wektory dzieli się na:

  • prokariotyczne, do których należą wektory plazmidowe, kosmidy, wektory fagowe i sztuczny chromosom bakteryjny;

  • eukariotyczne, do których należą pochodne wirusów, wektory drożdżowe, sztuczny chromosom ludzki i plazmid Ti.

Więcej informacji o wektorach znajdziesz w e‑materiale Wektory genetyczne.

R19put40zKEjs1
bg‑red

Etapy klonowania DNA

R1Ajsn4vJ7bLa1
Na ilustracji przedstawiony jest uproszczony schemat klonowania DNA. Cyfrą 1 zaznaczona jest okrągła ludzka komórka o okrągłym kształcie. W środku jej znajduje się jądro komórkowe w postaci pomarańczowego okręgu, w środku w nim znajduje się zwinięta nić DNA w kolorze czerwonym oznaczona cyfrą 2. Następnie to DNA jest podawane procesowi fragmentacji, czyli wyizolowaniu fragmentów DNA. Proces ten oznaczony jest cyfrą 3 i opisem: pierwszy etap klonowania DNA to fragmentacja. Fragment DNA przeznaczony do klonowania musi zostać wycięty z genomu komórki przez enzymy z grupy restryktaz – tzw. enzymy restrykcyjne. Są to enzymy przecinające nici DNA w miejscach wyznaczonych przez specyficzne sekwencje nukleotydowe. W efekcie uzyskuje się pocięty fragment DNA, którego końce są jednoniciowe i lepkie, tzn. mogą połączyć się z innymi jednoniciowymi fragmentami na zasadzie komplementarności. Następny obrazek przedstawia pierścień DNA w przybliżeniu wraz z enzymami restrykcyjnymi, które wycinają pewien jego fragment. Enzymy oznaczone są cyfrą 4 i przedstawione jako pomarańczowe kliny. Na dole schematu znajduje się bakteria oznaczona cyfrą 5. W środku jej znajduje się DNA w postaci nici oznaczonej cyfrą 7 oraz plazmid w kształcie ringu oznaczony cyfrą 8. Dochodzi do procesu przecięcia wektora, którym jest plazmid. Proces ten jest pod cyfrą 6 - z użyciem tych samych enzymów co podczas fragmentacji przecina się wektor, czyli np. plazmid, aby otrzymać fragmenty jednoniciowe komplementarne do fragmentów jednoniciowych fragmentu DNA, który chcemy sklonować. Następna ilustracja pokazuje plazmid w przybliżeniu w postaci pierścienia z odcinającymi z jego obwodu wycinek enzymami restrykcyjnymi, które są oznaczone cyfrą 9. Na schemacie pod liczbą 10 kolejno zaznaczony jest proces ligacji. Lepkie końce wektora i klonowanego DNA mogą zostać połączone za pomocą ligazy DNA. Ilustracja przedstawia plazmid, który zawiera gen reporterowy. Genem reporterowym może być np. gen oporności na wybrany antybiotyk. Ta część fragmentu plazmidu zaznaczona jest liczbą 11. Liczbą 12 z kolei zaznaczono proces transformacji, czyli umieszczenie wektora w docelowej komórce biorcy. Najczęstszym sposobem przeprowadzenia tego etapu jest dodanie roztworu wektorów do zawiesiny komórek, np. bakterii, o zwiększonej kompetencji, czyli zdolnych pobrać plazmid z otoczenia. Biorca powinien zapewnić ekspresję oraz namnażanie się klonowanego fragmentu. Na kolejnych ilustracjach pokazane jest jak komórka się rozmnaża – każda z nich duplikuje się.
Uproszczony schemat klonowania DNA.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.

Ostatnim etapem klonowania DNA jest selekcja, czyli wyodrębnienie bakterii, które przyjęły zrekombinowany plazmid wraz z genem reporterowym zapewniającym oporność na antybiotyk, od tych, które go nie mają. Po przeprowadzonej transformacji bakterie posiewa się na płytki z podłożem selekcyjnym z antybiotykiem. Bakterie bez plazmidu zginą; te zaś, które zyskały dzięki nowym genom antybiotykooporność, będą rosnąć na pożywkach odżywczych z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku, tworząc małe kolonie. Każda z nich będzie zawierać taki sam zrekombinowany plazmid z klonowanym fragmentem DNA.

Aby się upewnić, że uzyskane kolonie mają plazmid o prawidłowej strukturze, sprawdzane są pod kątem obecności zrekombinowanego genu. W tym celu wykorzystuje się reakcję PCRPCRreakcję PCR przeprowadzaną na wyizolowanych plazmidach z kilku kolonii lub trawienie za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. O obecności klonowanego DNA świadczy uzyskanie fragmentów DNA o określonej długości.

Więcej informacji o reakcji PCR znajdziesz w e‑materiale Łańcuchowa reakcja polimerazy.

bg‑red

Zastosowanie klonowania molekularnego

Techniki klonowania molekularnego są powszechnie stosowane w badaniach DNA, genów, ich funkcji oraz ekspresji. Dzięki nim możliwe stały się identyfikacja oraz izolacja genów, które są odpowiedzialne za występowanie różnych chorób. Stanowi to podłoże do zastosowania terapii genowej. Co więcej, sama terapia genowa wykorzystuje techniki klonowania DNA poprzez dostarczenie funkcjonalnych fragmentów DNA do komórek pacjentów.

Klonowanie DNA pozwala także na uzyskanie organizmów transgenicznych do produkcji ludzkich białek, np. bakterii produkujących ludzkie hormony wzrostu czy insulinę. Wykorzystywane jest również w produkcji szczepionek, które uzyskuje się poprzez tworzenie odpowiednich białek.

Ponadto klonowanie umożliwia tworzenie bibliotek genomowych i bibliotek cDNA. Więcej informacji na ten temat znajdziesz w e‑materiale Biblioteki genomowe i cDNA.

Słownik

Amp
Amp

gen oporności na ampicylinę

gen reporterowy
gen reporterowy

gen, którego aktywność można łatwo badać, wykorzystując np. metody histochemiczne lub fluorymetryczne; służący w biologii molekularnej do oceny poziomu ekspresji kontrolowanego przez badaną sekwencję regulatorową (np. promotor) w różnych tkankach, stadiach rozwoju lub w odpowiedzi na różne czynniki

GFP
GFP

(ang. green fluorescence protein – białko zielonej fluorescencji) białko, które pochodzi z meduzy Aequoria victoria; emituje zielone światło w wyniku wzbudzenia światłem niebieskim lub UV

MCS
MCS

(ang. multiple cloning sitemiejsce wielokrotnego klonowania) polilinker, odcinek DNA wektora genetycznego, w którym znajdują się liczne sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne

ori
ori

(ang. origin – początek) miejsce inicjacji replikacji

para zasad, pz
para zasad, pz

jednostka długości podwójnej nici DNA lub RNA; „para” oznacza dwie komplementarne zasady na dwóch niciach

PCR
PCR

(ang. polymerase chain reaction – reakcja łańcuchowa polimerazy) metoda powielania łańcuchów DNA polegająca na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki w warunkach laboratoryjnych

plazmid
plazmid

kolista cząsteczka DNA oddzielona od chromosomu i replikująca się niezależnie od niego

sekwencja nukleotydowa
sekwencja nukleotydowa

kolejność ułożenia czterech rodzajów nukleotydów w cząsteczce DNA lub RNA

zrekombinowana cząsteczka DNA
zrekombinowana cząsteczka DNA

cząsteczka DNA, która została wytworzona in vitro z fragmentów DNA pochodzących z różnych źródeł, np. po ligacji (połączeniu) sekwencji restrykcyjnych DNA szczura z plazmidami E. coli

zrekombinowany plazmid
zrekombinowany plazmid

plazmid, do którego został wprowadzony obcy fragment DNA