Przeczytaj
DNA – budowa i właściwości
Materiałem genetycznym większości organizmów jest DNA – kwas deoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid). Zbudowany jest on z dwóch nici (łańcuchów) polinukleotydowych tworzących strukturę podwójnej helisy. Struktura ta utrzymywana jest dzięki obecności wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi obu nici. Więcej informacji na temat budowy DNA znajdziesz w e‑materiale DNA jako nośnik informacji genetycznej.
Stabilizacja wiązań wodorowych zależy m.in. od stężenia soli oraz pH środowiska. Wahania tych parametrów mogą powodować destabilizację wiązań wodorowych. Natomiast wysoka temperatura (~95Indeks górny ooC) jest głównym czynnikiem powodującym pękanie wiązań wodorowych. W konsekwencji dochodzi do separacji obu nici kwasu nukleinowego (dwuniciowego DNA). Proces rozdzielenia podwójnej nici kwasu nukleinowego określa się mianem denaturacji lub topnienia. Temperatura topnienia zależy od liczby par G‑C: im jest ich więcej, tym temperatura musi być wyższa. Na denaturację wiązań wodorowych wpływa również obecność niektórych substancji chemicznych, takich jak formamidformamid.
Obniżenie temperatury lub usunięcie substancji denaturującej z badanej próby powoduje łączenie się komplementarnych jednoniciowych nici DNA w procesie zwanym renaturacją.
Temperatura, w jakiej 50% DNA ulega denaturacji, nazywa się temperaturą topnienia DNA (Tm).
Renaturacja – proces, podczas którego dochodzi do odtworzenia pierwotnie dwuniciowej struktury – stanowi jeden z przykładów hybrydyzacji. Hybrydyzacja to określenie używane do opisania spontanicznego łączenia się nukleotydów różnych kwasów nukleinowych. W wyniku tego procesu może dojść do tworzenia się połączeń między pojedynczymi nićmi: DNA‑DNA, RNA‑RNA lub DNA‑RNA. Zarówno szybkość łączenia się, jak i stabilność powstałych odcinków zależą od długości fragmentów oraz podobieństwa sekwencji nukleotydów. Powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych możliwe jest wtedy, gdy istnieją komplementarne odcinki kwasów nukleinowych o długości kilkunastu nukleotydów.
Zjawisko łączenia się komplementarnych fragmentów kwasów nukleinowych zostało wykorzystane w biologii molekularnej w technice zwanej hybrydyzacją. Polega ona na przyłączaniu wyznakowanych fragmentów kwasów nukleinowych do komplementarnych sekwencji. Takie wyznakowane izotopami lub chemicznie odcinki kwasów nukleinowych to sondy molekularne.
Sondy molekularne
Sondy molekularne mogą stanowić krótkie oligonukleotydyoligonukleotydy lub długie fragmenty kwasów nukleinowych. Ważną cechą sond molekularnych jest ich znakowanie, czyli przyłączanie określonych substancji (tzw. znaczników), które umożliwiają ich detekcję oraz wykrycie komplementarnych do nich fragmentów kwasów nukleinowych. Wcześniej sondy molekularne znakowane były głównie radioaktywnymi izotopami (32P, 35S, 14C), jednak związane z nimi zagrożenia, powodujące niedogodności w pracy laboratoryjnej, doprowadziły do wynalezienia metod znakowania nieradioaktywnego. W tym celu wykorzystuje się fluorofory – substancje o zdolności do fluorescencji. Wśród nich wyróżnić można takie związki jak fluoresceinafluoresceina, rodaminarodamina czy cyjaninycyjaniny.
Do znakowania sondy molekularnej wykorzystywane są enzymy. Znakowanie końca 5′ kwasu nukleinowego przeprowadza się przy użyciu kinazy polinukleotydowej, natomiast końca 3′ – z pomocą terminalnej transferazy deoksynukleotydowej.
Technika hybrydyzacji kwasów nukleinowych
Jak wspomniano, sondy molekularne wykorzystywane są w technice zwanej hybrydyzacją. Reakcje hybrydyzacji mogą być przeprowadzane w różny sposób. Z tego względu wyróżnia się hybrydyzację typu Southern blot (metodą Southerna) oraz northern blot. Techniki te stanowią podstawowe narzędzia w badaniu pojedynczych genów. Do metod opartych na hybrydyzacji należy także fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH, ang. fluorescent in situ hybrydization), która służy do identyfikacji sekwencji DNA w chromosomach lub jądrach interfazowych.
Typ hybrydyzacji | Cel | Materiał | Typ analizy | Typ sondy | Wykrywanie |
Southern blot | określenie lokalizacji lub wykrywanie obecności danej sekwencji DNA | wyizolowane DNA | DNA‑DNA | sondy DNA znakowane izotopowo lub nieradioaktywnie | autoradiografiaautoradiografia na kliszy rentgenowskiej |
---|---|---|---|---|---|
Northern blot | identyfikacja określonej sekwencji RNA | wyizolowane RNA | RNA‑DNA | sondy DNA znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie | autoradiografia na kliszy rentgenowskiej |
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) | wykrywanie określonej sekwencji DNA | nienaruszone chromosomy, komórki | DNA‑DNA | sondy DNA znakowane fluoroforami | mikroskop fluorescencyjny |
Modyfikacją klasycznej hybrydyzacji jest metoda mikromacierzy, polegająca na rozmieszczeniu sond molekularnych na podłożu zwanym mikromacierzą (ang. microarray). Może to być płytka szklana lub plastikowa, na której nanoszone są w regularnych odstępach sondy, różniące się sekwencjami. Do tych sond mogą przyłączać się cząsteczki DNA lub RNA, które będą wykazywały się wysokim stopniem komplementarności. W przeciwieństwie do innych metod, w przypadku mikromacierzy znakowany jest materiał badany, a nie sondy.
Dzięki miniaturyzacji technika ta pozwala na jednoczesną analizę ekspresji wielu, a czasami wszystkich genów w dwóch probówkach (np. pacjenta zdrowego i chorego). Materiał znajdujący się w obu próbkach znakowany jest różnymi barwnikami, tak aby możliwe było ich odróżnienie. Takie próbki kwasu nukleinowego hybrydyzuje się z mikromacierzą. Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji sond na mikromacierzy.
Odczyt mikromacierzy wykonywany jest za pomocą metody obrazowania umożliwiającej ilościowy pomiar sygnału fluorescencyjnego. Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości w próbce kwasu nukleinowego o danej sekwencji związanego z sondą. W przypadku braku różnic w ekspresji genów widoczna barwa będzie wypadkową obu znaczników. Przewaga jednego z kolorów świadczy o większej ekspresji w probówce zawierającej barwnik o danej fluorescencji.
Gdzie wykorzystywana jest technika hybrydyzacji?
Technika hybrydyzacji wykorzystywana jest w diagnostyce nowotworów oraz chorób zakaźnych i o podłożu genetycznym (m.in. fenyloketonurii, hemofilii). W badaniach naukowych metody oparte na hybrydyzacji stosuje się w celu analizy struktury kwasów nukleinowych, identyfikacji sekwencji powtórzonych oraz śledzenia aktywności komórek. Hybrydyzacja DNA pozwala również na określenie pokrewieństwa ewolucyjnego, a także identyfikację żywności genetycznie zmodyfikowanej. Co więcej, metoda ta jest wykorzystywana do monitorowania zmian środowiska, w tym określania bioróżnorodności mikroorganizmów.
Słownik
metoda obrazowania substancji promieniotwórczych
związek chemiczny emitujący fioletowe światło fluorescencyjne
organiczny związek emitujący zielonożółte światło fluorescencyjne
organiczny związek należący do amin stosowany jako rozpuszczalnik
fragment kwasu nukleinowego o długości od kilkunastu do kilkudziesięciu nukleotydów
organiczny związek emitujący czerwone światło fluorescencyjne
fragment jednoniciowego DNA znakowany substancjami o zdolnościach fluorescencyjnych; fluorochromy absorbują promieniowanie o określonej długości fali, a następnie emitują falę o innej długości fali