W bibliotekach genowych, nazywanych też bankami genowymi, przechowywane są zestawy sklonowanych fragmentów DNA składających się na kompletny genom danego organizmu lub pełny zestaw produktów transkrypcjitranskrypcjatranskrypcji. Banki genowe dzieli się na:

• biblioteki genomowe obejmujące zbiór fragmentów genomu organizmu powstały w wyniku klonowania DNA chromosomalnego i DNA organellarnego w wektorach genetycznychwektory genetycznewektorach genetycznych,

• biblioteki cDNAcDNAcDNA zawierające fragmenty cDNA, czyli fragmenty DNA powstające po przepisaniu informacji ze wszystkich wyizolowanych cząsteczek mRNA (transkryptomytranskryptomtranskryptomy) na DNA przy pomocy enzymu o nazwie odwrotna transkryptaza.

Bank genów jest miejscem do poszukiwania i izolacji genu. Istnieją także komercyjne banki genowe specjalizujące się w przechowywaniu DNA ludzkiego.

Tworzenie biblioteki genomowej rozpoczyna izolacja DNA genomowego (gDNA) danego organizmu. Wyizolowane gDNA zostaje poddane trawieniu restrykcyjnemu za pomocą enzymów restrykcyjnychenzym restrykcyjnyenzymów restrykcyjnych. Wolne końce uzyskanych w ten sposób fragmentów DNA łączone są z wektorem genetycznym – enzymem ligazą DNA. Następnie stworzone wektory wprowadzane są do komórek bakteryjnych lub drożdżowych. Komórki te, dzieląc się, powielają wprowadzony do nich fragment DNA. Bardzo ważne jest, aby dany wektor zawierał wyłącznie jeden fragment DNA genomowego – jednak ze względu na losowość cięcia enzymami restrykcyjnymi fragmenty DNA w różnych komórkach mogą się na siebie nakładać.

Wybór wektora genetycznego użytego do konstrukcji biblioteki genomowej zależy od wielkości genomu. Jest to spowodowane ograniczoną pojemnością wektorów. Przy tworzeniu biblioteki dla organizmu o dużym genomie niezbędne jest użycie wektora o dużej pojemności, dzięki czemu cały genom będzie zawarty w mniejszej liczbie klonów. Pojemność wektora zapisuje się zazwyczaj w kpzkpzkpz, czyli tysiącach par zasad.

RL6ssuZzrhrMO1

Zdjęcie przedstawia czterech biologów w laboratorium: dwie kobiety i dwóch mężczyzn. Kobieta na pierwszym planie trzyma w dłoni słoik z roślinami, podobnie jak mężczyzna na drugim planie. Biolodzy oglądają rośliny.

Biblioteka genomowa, która obejmuje cały materiał genetyczny danego gatunku, nosi nazwę reprezentatywnejbiblioteka reprezentatywnareprezentatywnej. Jest to zbiór zrekombinowanych wektorów zawierających fragmenty całego genomu organizmu. Wektory te, wyposażone w wydzielone geny, są doskonałym materiałem do klonowania DNA. Wystarczy wprowadzić zrekombinowany wektor do komórki (w komórkach bakteryjnych metodą transformacjitransformacjatransformacji, w eukariotycznych – transfekcjitransfekcjatransfekcji), a włączony do niego fragment DNA zostanie powielony (plazmidy są zdolne do samoreplikacji). Powstaną wówczas liczne kopie genu, czyli jego klony.

Stworzenie biblioteki genomowej jest o wiele łatwiejsze, jeżeli organizm ma mały genom. Po trawieniu restrykcyjnym można bowiem rozdzielić jego fragmenty za pomocą elektroforezy DNA. Pozwala to na klonowanie każdego z fragmentów pojedynczo. Bardzo ważny jest również dobór wektora. Przy próbie utworzenia biblioteki genomowej genomu człowieka (złożonego z około 3,2 miliarda par zasad) z użyciem wektora faga lambda potrzeba ok. 700 tysięcy klonów, aby z niemal całkowitą pewnością mieć cały genom w bibliotece.

Tworzenie biblioteki cDNA przebiega podobnie do tworzenia bibliotek genomowych, jednak wymaga innego przygotowania materiału do klonowania. W pierwszej kolejności niezbędna jest izolacja RNA z komórek, tkanek lub całego organizmu. Najważniejszą frakcję stanowi mRNA, na bazie którego dochodzi do syntezy białek. Możliwe jest oddzielenie frakcji mRNA z całości otrzymanego RNA poprzez modyfikację potranskypcyjną, polegającą na dodaniu tzw. ogonka poliA do mRNA. Ze względu na brak możliwości bezpośredniego połączenia wyizolowanego RNA z DNA wektorów, niezbędne jest przepisanie mRNA na cDNA. Można tego dokonać dzięki enzymowi – odwrotnej transkryptazie – zdolnemu do syntezy nici DNA na bazie mRNA.

Uzyskaną w ten sposób mieszaninę poddaje się działaniu enzymu RNAzy, który degraduje znajdujące się w próbce mRNA. Następnie odwrotna transkryptaza syntezuje jednoniciowe DNA. Synteza drugiej nici zachodzi dzięki polimerazie DNA. Tak otrzymane dwuniciowe DNA poddaje się trawieniu restrykcyjnemu. Kolejne etapy przebiegają analogicznie jak przy tworzeniu bibliotek genomowych.

Biblioteki cDNA stanowią zgromadzone w wektorach i umieszczone w komórce bakterii cDNA, które ogranicza się wyłącznie do genów aktywnych transkrypcyjnie. Ze względu na bardzo dynamiczny charakter frakcji mRNA w komórce – aktywność genów jest regulowana m.in. przez stadium rozwoju lub czynniki środowiskowe – biblioteki cDNA mogą się znacznie różnić w obrębie jednego organizmu.

Fragmenty cDNA są krótkie, zawierają do ok. 10 kpz, dlatego częstym wektorem w tworzeniu bibliotek cDNA są plazmidy. Fragmenty cDNA nie zawierają intronówintronyintronów, dlatego tworzone wektory mogą być wykorzystywane w procesach klonowania genów eukariotycznych.

Słownik