Inżynieria genetyczna - narzędzia i techniki

Rozwój biologii molekularnej w drugiej połowie XX wieku zapoczątkował gwałtowny postęp w badaniach nad funkcjonowaniem materiału genetycznego. Jednym z najważniejszych osiągnięć tego okresu było opracowanie technik inżynierii genetycznej, które umożliwiły bezpośrednią ingerencję w DNA organizmów. Dzięki nim naukowcy mogą izolować geny, modyfikować ich sekwencje, przenosić je między organizmami oraz kontrolować ich ekspresję

Enzymy wykorzystywane w biotechnologii molekularnej

Wprowadzenie zmian w DNA wymaga wykorzystania enzymów. Do najważniejszych z nich należą:

• polimerazy DNA,

• enzymy restrykcyjne (restryktazy),

• ligazy.

Enzymy charakteryzują się specyficznością substratową. Oznacza to, że mają zdolność do łączenia się z konkretnymi substratami i katalizują reakcje po odpowiednim dopasowaniu substratu do centrum aktywnego enzymu. Efektem tego zjawiska jest precyzyjna kontrola procesów zachodzących w komórkach.

Tworzenie hybrydowego DNA

Dzięki restryktazom i ligazom można precyzyjnie wyciąć wybrany gen z jednego organizmu i wstawić go do innej cząsteczki DNA, zwanej wektorem. Wektor to nośnik DNA – najczęściej mała, kolista cząsteczka DNA bakterii zwana plazmidem, która potrafi się samodzielnie namnażać w komórce. Wycięty fragment DNA, który chcemy wprowadzić do wektora, nazywamy wstawką.

Aby połączyć wstawkę z plazmidem, oba fragmenty tnie się tym samym enzymem restrykcyjnym. Powstają wtedy tzw. „lepkie końce”, czyli pasujące do siebie fragmenty DNA, które mogą się połączyć. Następnie ligazaskleja je, tworząc jedną cząsteczkę. DNA zawierający fragmenty pochodzące od co najmniej dwóch różnych organizmów (np. plazmid bakteryjny i wstawka z DNA wirusowego) nazywany jest DNA hybrydowym (zrekombinowanym).

Przed wykonaniem takiego eksperymentu przeprowadza się analizę restrykcyjną. Polega ona na sprawdzeniu, w których miejscach dana restryktaza przetnie DNA. Tworzy się tzw. mapę restrykcyjną, czyli schemat pokazujący miejsca cięcia w plazmidzie. Dzięki temu wiadomo, którego enzymu użyć i gdzie dokładnie DNA zostanie przecięte. Pozwala to zaplanować wstawienie genu w odpowiednie miejsce.

R1VRE642BAd7i

Schemat przedstawia przykładowy wektor plazmidowy pUC19. Ma on kształt pierścienia. W środku znajduje się napis pUC19. Na zewnątrz pierścienia znajdują się napisy: Ndc I, Eco0109 I, Aat II oraz Ssp I, Xmn I, Sca I, Eam1105 I, Akr N I oraz Afl III, Pvu II, Pvu I oraz Nar I. Są to nazwy enzymów, które przecinają plazmid we wskazanych miejscach.

Analiza restrykcyjna

Aby sprawdzić, czy doszło do połączenia (ligacji) wstawki z plazmidem oraz czy gen został wstawiony w odpowiedniej orientacji, wykonuje się analizę restrykcyjną. Polega ona na przecięciu uzyskanego hybrydowego DNA tymi samymi enzymami, których użyto do przygotowania wstawki i wektora.

W dalszym etapie, powstałe po restrykcji fragmenty należy rozdzielić i porównać ich wielkość.  Służy do tego elektroforeza DNA, która pozwala precyzyjnie odróżnić plazmid z nowym genem od plazmidu „pustego” na podstawie ich różnej długości.

Elektroforeza DNA

Elektroforeza to metoda polegająca na poruszaniu się naładowanych cząstek w polu elektrycznym. Cząstki o ładunku dodatnim dążą do elektrody ujemnej (katody), mające zaś ładunek ujemny – do elektrody dodatniej (anody).

Cząsteczki kwasów nukleinowych (DNA i RNA) posiadają grupy fosforanowe, przez co mają ładunek ujemny. W efekcie migrują one w stronę bieguna dodatniego, a szybkość tego procesu zależy od ich wielkości – im krótsza cząsteczka DNA lub RNA, tym szybciej przemieszcza się ona w kierunku anody. 

Elektroforeza żelowa pozwala na rozdzielenie kwasów nukleinowych w porowatym żelu. Żel to substancja o konsystencji galarety, składająca się z agarozy lub poliakrylamidu. Wylewa się go do specjalnej formy, w której tworzy cienką warstwę. Struktura żelu działa jak sito, umożliwiając separację cząsteczek w polu elektrycznym. 

W żelu znajdują się studzienki, w których umieszcza się próbki (np. plazmidy po trawieniu enzymami restrykcyjnymi). Oprócz badanych cząsteczek, na żel nanosi się również marker masy (tzw. drabinkę DNA – ang. DNA ladder), czyli mieszaninę fragmentów kwasu nukleinowego o znanej długości, która służy jako układ odniesienia.

Żel umieszcza się w aparacie do elektroforezy wypełnionym buforem, a następnie poddaje działaniu pola elektrycznego. Pod jego wpływem fragmenty kwasów nukleinowych migrują od katody w stronę anody z różną szybkością. Mniejsze cząsteczki przemieszczają się szybciej, gdyż łatwiej przeciskają się przez pory żelu, podczas gdy cząsteczki znacznie większe od porów pozostają niemal nieruchome.

Ponieważ DNA jest bezbarwne, do próbek dodaje się barwnik, który pozwala śledzić postęp elektroforezy. Aby jednak uwidocznić same prążki DNA, stosuje się barwniki fluorescencyjne (np. bromek etydyny), które wymagają obserwacji w świetle UV. Proces zazwyczaj prowadzi się pod napięciem 100–120 V przez około 20–30 minut.

Po zakończonej elektroforezie żel analizuje się w świetle UV. Rozdzielone fragmenty widoczne są w postaci prążków dzięki świeceniu barwników fluorescencyjnych wiążących się z DNA.

Wielkość fragmentów DNA określa się na podstawie porównania ich szybkości migracji w żelu (na podstawie pozycji odpowiednich prążków) z szybkością migracji fragmentów DNA o znanej długości (pozycje prążków z drabinki).

Liczba prążków świadczy o tym, ile miejsc restrykcyjnych zostało rozpoznanych przez enzymy restrykcyjne w danej cząsteczce DNA.

Sondy molekularne i hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Sonda molekularna to krótki, jednoniciowy fragment kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) o znanej sekwencji nukleotydów, który służy do wykrywania określonych, komplementarnych do niego sekwencji w badanej próbie materiału genetycznego.

Ważną cechą sond molekularnych jest ich znakowanie, czyli przyłączanie określonych substancji (tzw. znaczników), które umożliwiają ich detekcję oraz wykrycie komplementarnych do nich fragmentów kwasów nukleinowych. W tym celu wykorzystuje się fluorofory – substancje o zdolności do fluorescencji w świetle UV. Wśród nich wyróżnić można takie związki jak fluoresceinafluoresceinafluoresceina, rodaminarodaminarodamina czy cyjaninycyjaninacyjaniny.

RIOP0aYaxThAv

Na zdjęciu znajdują się wodne roztwory związków o zdolności do fluorescencji w świetle UV. Roztwory znajdują się w walcowatych zlewkach oraz w kolbie stożkowej w postaci stożka zakończonego wąskim kominem. Mają one kolor czerwony, niebieski, biały, żółty oraz zielony. Tło zdjęcia jest czarne.

Sondy molekularne działają w oparciu o zjawisko hybrydyzacji, czyli parowania się ze sobą komplementarnych nici kwasów nukleinowych. Są wykorzystywane do wykrywania:

• konkretnych genów w genomie - hybrydyzacja Southern blot,

• produktów ekspresji konkretnych genówu - hybrydyzacja northern blot,

• sekwencji DNA bezpośrednio w chromosomach lub jądrach interfazowych - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ - FISH. 

Znakowaną sondę o znanej sekwencji dodaje się do mieszaniny jednoniciowych cząsteczek DNA lub RNA, a następnie poddaje inkubacji. Jeśli w badanej próbce znajduje się poszukiwana sekwencja, sonda trwale się z nią łączy (hybrydyzuje). Ponieważ sonda posiada znacznik (np. cząsteczkę fluorescencyjną), wynik sprawdza się poprzez detekcję sygnału – tam, gdzie pojawi się sygnał znacznika, tam znajduje się szukany gen lub jego produkt. 

R1cWaIv8FQnWi1

Na ilustracji znajduje się fragment mikromacierzy dwukolorowej. Składa się on z punktów ustawionych w równe rzędy, które umieszczone są jeden w drugim. Punkty mają różne odcienie zielonego, od bardzo ciemny po jaskrawozielony, niemal żółty.

Modyfikacją klasycznej hybrydyzacji jest metoda mikromacierzy, polegająca na rozmieszczeniu sond molekularnych na podłożu zwanym mikromacierzą (ang. microarray). Może to być płytka szklana lub plastikowa, na której nanoszone są w regularnych odstępach sondy, różniące się sekwencjami. Do tych sond mogą przyłączać się cząsteczki DNA lub RNA, które będą wykazywały się wysokim stopniem komplementarności. W przeciwieństwie do innych metod, w przypadku mikromacierzy znakowany jest materiał badany, a nie sondy.

Dzięki miniaturyzacji technika wykorzystania mikromacierzy ta pozwala na jednoczesną analizę ekspresji wielu, a czasami wszystkich genów w dwóch probówkach (np. pacjenta zdrowego i chorego). Materiał znajdujący się w obu próbkach znakowany jest różnymi barwnikami, tak aby możliwe było ich odróżnienie. Takie próbki kwasu nukleinowego hybrydyzuje się z mikromacierzą. Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji sond na mikromacierzy.

Odczyt mikromacierzy wykonywany jest za pomocą metody obrazowania umożliwiającej ilościowy pomiar sygnału fluorescencyjnego. Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości w próbce kwasu nukleinowego o danej sekwencji związanego z sondą. W przypadku braku różnic w ekspresji genów widoczna barwa będzie wypadkową obu znaczników. Przewaga jednego z kolorów świadczy o większej ekspresji w probówce zawierającej barwnik o danej fluorescencji.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Reakcja łańcuchowa polimerazy - PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) to technika powielania fragmentu DNA w ilościach sięgających milionów, a nawet miliardów kopii w krótkim czasie.  

Metoda ta została opracowana w USA w 1983 r. przez zespół Kary’ego Mullisa, za którą Mullis w 1993 r. otrzymał Nagrodę Nobla.

Reakcję PCR przeprowadza się w termocyklerachtermocyklertermocyklerach mieszaninie reakcyjnej o zdefiniowanym składzie. Polega ona na  wielokrotnym powtarzaniu określonych etapów, które zachodzą w różnych temperaturach, a każda zmiana temperatury wyznacza koniec danego etapu.

W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi matrycowe DNA, które służy jako podstawa do namnożenia określonego fragmentu. Może to być DNA genomowe wyizolowane z danego organizmu, plazmid, izolat DNA z próbki biologicznej o nieznanej sekwencji czy wcześniej uzyskany fragment DNA po działaniu restryktaz.

W zależności od celu wykorzystania reakcji PCR projektuje się odpowiednie startery (primery), które pozwalają na wyznaczenie obu końców powielanej sekwencji DNA. Startery to krótkie sekwencje DNA, zawierające zazwyczaj ok. 20 nukleotydów. 

Startery umożliwiają przyłączenie polimerazy DNA– enzymu syntetyzującego nową nić na matrycy DNA. W reakcji PCR używa się termostabilnych polimeraz, takich jak polimeraza Taq (z bakterii Thermus aquaticus), która wykazuje maksymalną aktywność w temp. 75–80°C.  Jest to szczególnie ważna cecha – denaturację DNA w reakcji PCR osiąga się przez ogrzanie mieszaniny do temperatury 95–98°C, a więc takiej, w której inne polimerazy ulegają inaktywacji. Podczas syntezy nowych nici DNA polimeraza zużywa nukleotydy, które dostarczone są w postaci mieszaniny. Mieszanina ta często opisywana jest jako dNTP (trifosforany deoksyrybonukleozydowetrifosforany deoksyrybonukleozydowetrifosforany deoksyrybonukleozydowe), a w jej skład wchodzą: dATP, gGTP, dCTP oraz dTTP, odpowiadając kolejno: nukleotydowi adeninowemu, guaninowemu, cytozynowemu i tyminowemu. 

Przebieg PCR

Reakcja PCR składa się z trzech etapów:

• denaturacji,

• przyłączania,

• elongacji.

Wszystkie trzy etapy powtarza się cyklicznie (zazwyczaj od 25 do 35 razy). Ponieważ każda nowa nić staje się matrycą w kolejnym cyklu, liczba kopii DNA rośnie wykładniczo. W efekcie w ciągu krótkiego czasu można otrzymać miliony identycznych fragmentów DNA, których długość i końce są precyzyjnie wyznaczone przez sekwencje użytych starterów.

Zalety i wady PCR

Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera

Sekwencjonowanie DNA jest jedną z podstawowych metod genetyki molekularnej, polegającą na odczytywaniu kolejności nukleotydów w nici DNA. 

Sekwencjonowanie DNA przeprowadza się kilkoma metodami. Jedną z nich jest metoda enzymatyczna, znana również jako metoda Sangera (od nazwiska jej twórcy, Fredericka Sangera) lub metodą terminacji łańcucha. Pomimo upływu lat, po licznych modyfikacjach, technika ta jest z powodzeniem stosowana do dziś. 

Cechą charakterystyczną metody Sangera  jest wykorzystanie dideoksynukleotydów (ddNTP), które pełnią rolę „stoperów” podczas tworzenia nowej cząsteczki DNA. Są to tzw. nukleotydy terminalne. W normalnym DNA nukleotydy (dNTP) mają grupę -OH, która pozwala na dołączenie do nich kolejnego nukleotydu. Dideoksynukleotydy (ddNTP) nie posiadają tej grupy. W rezultacie, gdy polimeraza DNA wbuduje ddNTP zamiast zwykłego nukleotydu, proces wydłużania nici zostaje przerwany. W efekcie powstaje zestaw fragmentów DNA o wszystkich możliwych długościach, z których każdy kończy się specyficznym ddNTP.

Sekwencjonowanie metodą Sangera prowadzi się w czterech probówkach o różnym składzie: 

1. probówka „A”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddATP, polimeraza DNA;

2. probówka „G”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddGTP, polimeraza DNA;

3. probówka „C”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddCTP, polimeraza DNA;

4. probówka „T”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddTTP, polimeraza DNA..

Po zakończeniu sekwencjonowania przeprowadzana jest elektroforeza, która ma na celu pokazanie nukleotydów terminalnych, czyli znajdujących się na końcu każdej z nici DNA. Po naświetleniu żelu, na którym są rozdzielone nukleotydy każdej z czterech probówek, można uzyskać obraz wyłącznie nukleotydów dołączonych na nowo i pokazać je na chromatogramie.

Ciekawostka

RKwQZ9MxlunNB1

Zdjęcie przedstawia laboratorium. Po lewej stronie widoczne jest dygestorium, po prawej regał z ponumerowanymi książkami.

Mitochondrialny genom człowieka zsekwencjonowano już w 1981 r., co przyczyniło się do podjęcia próby poznania sekwencji całego genomu człowieka. Wyniki Projektu poznania ludzkiego genomu (ang. Human Genome Project), trwającego od 1990 do 2003 r., opublikowano w 2001 r. Poznanie sekwencji genomu nie stanowiło jednak zakończenia całego procesu. Następnym zadaniem było udzielenie odpowiedzi na pytanie o rolę danych sekwencji, a także ich wpływ na funkcjonowanie genomu. Badania te prowadzone są nadal.

Wektory i klonowanie DNA

Klonowanie DNA to proces polegający na namnożeniu (powieleniu) danego fragmentu DNA w komórkach, zwykle bakterii Escherichia coli, przy zastosowaniu specjalnego nośnika DNA – wektora genetycznego.

Wektory genetyczne

Wektor połączony z fragmentem DNA, który ma zostać skopiowany  (najczęściej zawierający konkretny gen lub geny) tworzy cząsteczkę zrekombinowanego DNA.

R1TSApnbdDqNO

Schemat przedstawia powstawanie wektora plazmitowego. Pierwsza ilustracja obrazuje ludzką komórkę o okrągłym kształcie. W środku jej znajduje się jądro komórkowe w postaci pomarańczowego okręgu, w środku w nim znajduje się zwinięta nić DNA w kolorze czerwonym. Barwą żółtą zaznaczony jest jeden fragment nici - jest to gen kodujący insulinę. Poniżej znajduje się plazmid w kształcie ringu. Na kolejnej ilustracji plazmid ma z usunięty fragmentem. Na jego miejsce wszczepiono z kolei gen kodujący insulinę. Trzecia ilustracja pokazuje zrekombinowany DNA, już z wszczepionym fragmentem.

Jako wektory genetyczne wykorzystuje się plazmidy, sztuczne chromosomy oraz różne typy wirusów, w tym fagi dla bakterii oraz wektory wirusowe dla komórek eukariotycznych. 

Aby cząsteczka DNA mogła być wektorem genetycznym musi posiadać następujące cechy:

• zawierać miejsce rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne;

• zawierać marker selekcyjnymarker selekcyjnymarker selekcyjny, pozwalający na selekcję komórek gospodarza zawierających wektor;

• zawierać miejsce inicjacji replikacji tzw. ori;

• musi być łatwa do izolowania z komórek gospodarza.

Klonowanie DNA

Do przeprowadzenia klonowania DNA niezbędne są:

• docelowy fragment DNA zawierający gen, który ma zostać powielony (sklonowany) do komórki;

• wektor genetyczny – służący jako nośnik fragmentu DNA przeznaczonego do sklonowania;

• enzymy restrykcyjne – służące do wycięcia wybranego fragmentu DNA z genomu organizmu, z którego zostanie pobrany, oraz przecięcia wektora, np. plazmidu; enzymy te rozpoznają swoiste sekwencje w dwuniciowej cząsteczce DNA, nazywane miejscami restrykcyjnymi, i przecinają DNA w danym miejscu;

• ligaza – enzym umożliwiający połączenie wyciętego fragmentu DNA z DNA wektora;

• gen selekcyjny – znacznik pokazujący, czy procedura się powiodła.

Etapy klonowania DNA

Klonowanie DNA można podzielić na dwa etapy:

1. otrzymanie zrekombinowanego DNA poprzez wyizolowanie określonego genu i przeniesienie go do wektora;

2. wprowadzenie wektora ze wstawionym genem do wybranej komórki i powielenie go na skutek replikacji.

Po zakończeniu klonowania DNA przeprowadza się selekcję, czyli wyodrębnienie bakterii, które przyjęły zrekombinowany plazmid wraz z genem reporterowym zapewniającym oporność na antybiotyk, od tych, które go nie mają. Po przeprowadzonej transformacji bakterie posiewa się na płytki z podłożem selekcyjnym z antybiotykiem. Bakterie bez plazmidu zginą; te zaś, które zyskały dzięki nowym genom antybiotykooporność, będą rosnąć na pożywkach  z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku, tworząc małe kolonie. Każda z nich będzie zawierać taki sam zrekombinowany plazmid z klonowanym fragmentem DNA.

Aby się upewnić, że uzyskane kolonie mają plazmid o prawidłowej strukturze, sprawdzane są pod kątem obecności zrekombinowanego genu. W tym celu wykorzystuje się reakcję PCR przeprowadzaną na wyizolowanych plazmidach z kilku kolonii lub trawienie za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. O obecności klonowanego DNA świadczy uzyskanie fragmentów DNA o określonej długości.

Biblioteki genomowe i biblioteki cDNA

W bibliotekach genowych, nazywanych też bankami genowymi, przechowywane są zestawy sklonowanych fragmentów DNA składających się na kompletny genom danego organizmu lub pełny zestaw produktów transkrypcji. Banki genowe dzieli się na:

• biblioteki genomowe obejmujące zbiór fragmentów genomu organizmu powstały w wyniku klonowania DNA chromosomalnego i DNA organellarnego w wektorach genetycznych,

• biblioteki cDNA zawierające fragmenty cDNA, czyli fragmenty DNA powstające po przepisaniu informacji ze wszystkich wyizolowanych cząsteczek mRNA (transkryptomy) na DNA przy pomocy enzymu o nazwie odwrotna transkryptaza.

Bank genów jest miejscem do poszukiwania i izolacji genu. Istnieją także komercyjne banki genowe specjalizujące się w przechowywaniu DNA ludzkiego.

Tworzenie bibliotek genomowych

Tworzenie biblioteki genomowej rozpoczyna izolacja DNA genomowego (gDNA) danego organizmu. Wyizolowane gDNA zostaje poddane trawieniu restrykcyjnemu za pomocą enzymów restrykcyjnych. Wolne końce uzyskanych w ten sposób fragmentów DNA łączone są z wektorem genetycznym ligazą DNA. Następnie stworzone wektory wprowadzane są do komórek bakteryjnych lub drożdżowych. Komórki te, dzieląc się, powielają wprowadzony do nich fragment DNA. Bardzo ważne jest, aby dany wektor zawierał wyłącznie jeden fragment DNA genomowego – jednak ze względu na losowość cięcia enzymami restrykcyjnymi fragmenty DNA w różnych komórkach mogą się na siebie nakładać.

Tworzenie bibliotek cDNA

Tworzenie biblioteki cDNAcDNAcDNA przebiega podobnie do tworzenia bibliotek genomowych, jednak wymaga innego przygotowania materiału do klonowania. W pierwszej kolejności niezbędna jest izolacja mRNA z komórek, tkanek lub całego organizmu. Ze względu na brak możliwości bezpośredniego połączenia wyizolowanego mRNA z DNA wektorów, niezbędne jest „przepisanie” mRNA na cDNA. Można tego dokonać dzięki enzymowi – odwrotnej transkryptazie – zdolnemu do syntezy nici DNA na bazie mRNA. Synteza drugiej nici zachodzi dzięki polimerazie DNA. Tak otrzymane dwuniciowe DNA poddaje się trawieniu restrykcyjnemu. Kolejne etapy przebiegają analogicznie jak przy tworzeniu bibliotek genomowych.

Biblioteki cDNA stanowią zgromadzone w wektorach i umieszczone w komórce bakterii cDNA, które ogranicza się wyłącznie do genów aktywnych transkrypcyjnie - nie zawierają intronów, dlatego tworzone wektory mogą być wykorzystywane w procesach klonowania genów eukariotycznych.

Podsumowanie

• Inżynieria genetyczna rozwinęła się wraz z postępem biologii molekularnej i umożliwia bezpośrednią ingerencję w DNA, w tym izolowanie, modyfikowanie, klonowanie i analizę genów oraz kontrolę ich ekspresji.

• Podstawowymi narzędziami biotechnologii molekularnej są enzymy:
  - polimerazy DNA – katalizują syntezę DNA na matrycy DNA lub RNA (np. odwrotna transkryptaza); są kluczowe w reakcji PCR i analizie ekspresji genów;
  - enzymy restrykcyjne – tną DNA w ściśle określonych sekwencjach, umożliwiając otrzymywanie fragmentów DNA, tworzenie rekombinowanego DNA oraz map restrykcyjnych;
  - ligazy DNA – łączą fragmenty DNA poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych, co pozwala na wstawianie genów do wektorów.

• Analiza restrykcyjna polega na trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi i identyfikacji powstałych fragmentów na podstawie ich długości; umożliwia sprawdzenie obecności i orientacji wstawki DNA w plazmidzie.

• Elektroforeza DNA jest techniką rozdziału fragmentów kwasów nukleinowych w polu elektrycznym; pozwala porównywać długość fragmentów DNA na podstawie ich migracji w żelu i wizualizacji prążków.

• Hybrydyzacja DNA wykorzystuje sondy molekularne do wykrywania komplementarnych sekwencji DNA lub RNA; obejmuje m.in. metody Southern blot, Northern blot, FISH oraz mikromacierze DNA.

• Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) umożliwia szybkie i wielokrotne powielanie wybranego fragmentu DNA; znajduje zastosowanie w diagnostyce medycznej, kryminalistyce, biologii molekularnej i biotechnologii.

• Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera pozwala na odczytanie kolejności nukleotydów w DNA; jest wykorzystywane w badaniach naukowych, diagnostyce chorób genetycznych i nowotworowych.

• Klonowanie DNA polega na namnażaniu fragmentów DNA w komórkach gospodarza z użyciem wektorów genetycznych (np. plazmidów); prowadzi do otrzymania zrekombinowanego DNA.

• Biblioteka genomowa - jest zbiorem sklonowanych fragmentów całego genomu organizmu; zawiera zarówno geny kodujące, jak i sekwencje niekodujące. Stosowana jest m.in. do badań struktury genomu i lokalizacji genów.

• Biblioteka cDNA - jest zbiorem sklonowanych fragmentów DNA powstałych na podstawie mRNA wyizolowanego z określonej tkanki lub komórek; nie zawiera intronów ani sekwencji niekodujących, ponieważ cDNA powstaje z dojrzałego mRNA przy udziale odwrotnej transkryptazy. Jest wykorzystywana m.in. do analizy ekspresji genów oraz produkcji białek w organizmach prokariotycznych.

• Biblioteki genomowe i biblioteki cDNA stanowią zbiory sklonowanych fragmentów DNA i są podstawowym źródłem do identyfikacji, izolacji i analizy genów, w tym genów aktywnych transkrypcyjnie.

• Techniki inżynierii genetycznej mają kluczowe znaczenie w medycynie, biotechnologii, przemyśle i nauce, umożliwiając rozwój diagnostyki, terapii oraz badań nad funkcją genów

Ćwiczenia utrwalające