Inżynieria genetyczna - narzędzia i techniki

Rozwój biologii molekularnej w drugiej połowie XX wieku zapoczątkował gwałtowny postęp w badaniach nad funkcjonowaniem materiału genetycznego. Jednym z najważniejszych osiągnięć tego okresu było opracowanie technik inżynierii genetycznej, które umożliwiły bezpośrednią ingerencję w DNA organizmów. Dzięki nim naukowcy mogą izolować geny, modyfikować ich sekwencje, przenosić je między organizmami oraz kontrolować ich ekspresję

Enzymy wykorzystywane w biotechnologii molekularnej

Wprowadzenie zmian w DNA wymaga wykorzystania enzymów. Do najważniejszych z nich należą:

• polimerazy DNA,

• enzymy restrykcyjne (restryktazy),

• ligazy.

Enzymy charakteryzują się specyficznością substratową. Oznacza to, że mają zdolność do łączenia się z konkretnymi substratami i katalizują reakcje po odpowiednim dopasowaniu substratu do centrum aktywnego enzymu. Efektem tego zjawiska jest precyzyjna kontrola procesów zachodzących w komórkach.

Tworzenie rekombinowanego DNA

Dzięki restryktazom i ligazom można precyzyjnie wyciąć wybrany gen z jednego organizmu i wstawić go do innej cząsteczki DNA, zwanej wektorem. Wektor to nośnik DNA – najczęściej mała, kolista cząsteczka DNA bakterii zwana plazmidem, która potrafi się samodzielnie namnażać w komórce. Wycięty fragment DNA, który chcemy wprowadzić do wektora, nazywamy wstawką.

Przed wykonaniem takiego eksperymentu przeprowadza się analizę restrykcyjną. Polega ona na określeniu miejsc, w których wybrane enzymy restrykcyjne przecinają DNA. Na tej podstawie tworzy się mapę restrykcyjną, czyli schemat przedstawiający miejsca cięcia w plazmidzie lub innym fragmencie DNA. Dzięki temu można wybrać odpowiedni enzym restrykcyjny i zaplanować wstawienie genu we właściwe miejsce.

R1VRE642BAd7i

Schemat przedstawia przykładowy wektor plazmidowy pUC19. Ma on kształt pierścienia. W środku znajduje się napis pUC19. Na zewnątrz pierścienia znajdują się napisy: Ndc I, Eco0109 I, Aat II oraz Ssp I, Xmn I, Sca I, Eam1105 I, Akr N I oraz Afl III, Pvu II, Pvu I oraz Nar I. Są to nazwy enzymów, które przecinają plazmid we wskazanych miejscach.

W celu połączenia wstawki z plazmidem, oba fragmenty tnie się tym samym enzymem restrykcyjnym. Jeśli powstają wtedy tzw. „lepkie końce”, czyli komplementarne fragmenty jednoniciowego DNA, mogą one połączyć się ze sobą. Następnie ligaza scala je, tworząc jedną cząsteczkę DNA. DNA zawierający fragmenty pochodzące z różnych źródeł (np. plazmid bakteryjny i wstawka z DNA wirusowego) nazywany jest DNA rekombinowanym (hybrydowym).

Aby sprawdzić, czy doszło do połączenia (ligacji) wstawki z plazmidem oraz czy gen został wstawiony w odpowiedniej orientacji, wykonuje się analizę restrykcyjną uzyskanego rekombinowanego DNA odpowiednio dobranymi enzymami restrykcyjnymi. W dalszym etapie powstałe fragmenty rozdziela się i analizuje pod względem wielkości za pomocą elektroforezy DNA. 

Elektroforeza DNA

Elektroforeza to metoda polegająca na przemieszczaniu się naładowanych cząstek w polu elektrycznym. Cząstki o ładunku dodatnim dążą do elektrody ujemnej (katody), mające zaś ładunek ujemny – do elektrody dodatniej (anody).

Cząsteczki kwasów nukleinowych (DNA i RNA) posiadają grupy fosforanowe, przez co mają ładunek ujemny. W efekcie migrują one w stronę bieguna dodatniego, a szybkość tego procesu zależy od ich wielkości – im krótsza cząsteczka DNA lub RNA, tym szybciej przemieszcza się ona w kierunku anody. 

Elektroforeza żelowa pozwala na rozdzielenie kwasów nukleinowych w porowatym żelu. Żel to substancja o konsystencji galarety, składająca się z agarozy lub poliakrylamidu. Wylewa się go do specjalnej formy, w której tworzy cienką warstwę. Struktura żelu działa jak sito, umożliwiając separację cząsteczek w polu elektrycznym. 

W żelu znajdują się studzienki, w których umieszcza się próbki (np. plazmidy po trawieniu enzymami restrykcyjnymi). Oprócz badanych cząsteczek, na żel nanosi się również marker długości fragmentów DNA (tzw. drabinkę DNA – ang. DNA ladder), czyli mieszaninę fragmentów kwasu nukleinowego o znanej długości, która służy jako układ odniesienia.

Żel umieszcza się w aparacie do elektroforezy wypełnionym buforem, a następnie poddaje działaniu pola elektrycznego. Pod jego wpływem fragmenty kwasów nukleinowych migrują od katody w stronę anody z różną szybkością. Mniejsze cząsteczki przemieszczają się szybciej, gdyż łatwiej przeciskają się przez pory żelu, podczas gdy cząsteczki znacznie większe od porów poruszają się wolniej lub pozostają niemal nieruchome.

Ponieważ DNA jest bezbarwne, do próbek dodaje się barwnik, który pozwala śledzić postęp elektroforezy. Aby jednak uwidocznić same prążki DNA, stosuje się barwniki fluorescencyjne (np. bromek etydyny), które wymagają obserwacji w świetle UV. Proces prowadzi się przez określony czas pod odpowiednio dobranym napięciem, aż do uzyskania rozdziału fragmentów DNA

Po zakończonej elektroforezie żel analizuje się w świetle UV. Rozdzielone fragmenty widoczne są w postaci prążków dzięki świeceniu barwników fluorescencyjnych wiążących się z DNA.

Wielkość fragmentów DNA określa się na podstawie porównania ich szybkości migracji w żelu (na podstawie pozycji odpowiednich prążków) z szybkością migracji fragmentów DNA o znanej długości (pozycje prążków z drabinki).

Liczba obserwowanych prążków odpowiada liczbie fragmentów DNA o określonej długości uzyskanych po cięciu, a nie zawsze bezpośrednio liczbie miejsc cięcia. Liniowe DNA przecięte w n miejscach daje zwykle n+1 fragmentów, natomiast koliste DNA – n fragmentów (jeśli każde miejsce cięcia występuje tylko raz). Fragmenty o jednakowej długości migrują w żelu w tym samym miejscu i tworzą wspólny prążek. .

Sondy molekularne i hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Sonda molekularna to krótki, jednoniciowy fragment kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) o znanej sekwencji nukleotydów, który służy do wykrywania określonych, komplementarnych do niego sekwencji w badanej próbie materiału genetycznego.

Sondę wyposaża się w znacznik umożliwiający jej wykrycie. Może nim być np. substancja fluorescencyjna, np. fluoresceinafluoresceinafluoresceina, rodaminarodaminarodamina czy cyjaninycyjaninacyjaniny.

RIOP0aYaxThAv

Na zdjęciu znajdują się wodne roztwory związków o zdolności do fluorescencji w świetle UV. Roztwory znajdują się w walcowatych zlewkach oraz w kolbie stożkowej w postaci stożka zakończonego wąskim kominem. Mają one kolor czerwony, niebieski, biały, żółty oraz zielony. Tło zdjęcia jest czarne.

Sondy molekularne działają w oparciu o zjawisko hybrydyzacji, czyli parowania się ze sobą komplementarnych nici kwasów nukleinowych. Są wykorzystywane do wykrywania:

• określonych sekwencji DNA - hybrydyzacja Southern blot,

• określonych cząsteczek RNA - hybrydyzacja northern blot,

• określonych sekwencji DNA bezpośrednio w chromosomach lub jądrach interfazowych - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ - FISH. 

Znakowaną sondę o znanej sekwencji dodaje się do mieszaniny jednoniciowych cząsteczek DNA lub RNA, a następnie poddaje inkubacji. Jeśli w badanej próbce znajduje się poszukiwana sekwencja, sonda trwale się z nią łączy (hybrydyzuje). Ponieważ sonda posiada znacznik (np. cząsteczkę fluorescencyjną), wynik sprawdza się poprzez detekcję sygnału – tam, gdzie pojawi się sygnał znacznika, tam znajduje się szukana sekwencja kwasu nukleinowego (np. gen lub jego produkt). 

R1cWaIv8FQnWi1

Na ilustracji znajduje się fragment mikromacierzy dwukolorowej. Składa się on z punktów ustawionych w równe rzędy, które umieszczone są jeden w drugim. Punkty mają różne odcienie zielonego, od bardzo ciemny po jaskrawozielony, niemal żółty.

Modyfikacją klasycznej hybrydyzacji jest metoda mikromacierzy, polegająca na rozmieszczeniu sond molekularnych na podłożu zwanym mikromacierzą (ang. microarray). Może to być płytka szklana lub plastikowa, na której nanoszone są w regularnych odstępach sondy, różniące się sekwencjami. Do tych sond mogą przyłączać się cząsteczki DNA lub RNA, które będą wykazywały się wysokim stopniem komplementarności. W przeciwieństwie do innych metod, w przypadku mikromacierzy znakowany jest materiał badany, a nie sondy.

Dzięki miniaturyzacji technika wykorzystania mikromacierzy ta pozwala na jednoczesną analizę ekspresji bardzo wielu genów w dwóch próbkach (np. pacjenta zdrowego i chorego). Materiał znajdujący się w obu próbkach znakowany jest różnymi barwnikami, tak aby możliwe było ich odróżnienie. Takie próbki kwasu nukleinowego hybrydyzuje się z mikromacierzą. Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji sond na mikromacierzy.

Odczyt mikromacierzy wykonywany jest za pomocą metody obrazowania umożliwiającej ilościowy pomiar sygnału fluorescencyjnego. Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości w próbce kwasu nukleinowego o danej sekwencji związanego z sondą. W przypadku braku różnic w ekspresji genów widoczna barwa będzie wypadkową obu znaczników. Przewaga jednego z kolorów świadczy o większej ekspresji w probówce zawierającej barwnik o danej fluorescencji.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Reakcja łańcuchowa polimerazy - PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) jest metodą umożliwiającą szybkie otrzymanie wielu kopii wybranego fragmentu DNA w krótkim czasie. Metoda ta została opracowana w USA w 1983 r. przez zespół Kary’ego Mullisa,za którą Mullisw 1993 r. otrzymał Nagrodę Nobla.

Reakcję PCR przeprowadza się w termocyklerachtermocyklertermocyklerach w mieszaninie reakcyjnej, która zawiera matrycowe DNA, dwa startery, termostabilną polimerazę DNA, nukleotydy i odpowiedni bufor. Polega ona na  wielokrotnym powtarzaniu określonych etapów, które zachodzą w różnych temperaturach, a każda zmiana temperatury wyznacza koniec danego etapu.

Matrycowe DNA, służy jako podstawa do namnożenia określonego fragmentu. Może to być DNA genomowe wyizolowane z danego organizmu, plazmid, izolat DNA z próbki biologicznej o nieznanej sekwencji czy wcześniej uzyskany fragment DNA po działaniu restryktaz.

W zależności od celu wykorzystania reakcji PCR projektuje się odpowiednie startery (primery). Są to krótkie fragmenty DNA, które przyłączają się do nici matrycowych po obu stronach powielanego odcinka. Wyznaczają początek i koniec powielanego fragmentu oraz umożliwiają polimerazie rozpoczęcie syntezy DNA.

Startery dostarczają wolnego końca 3’-OH, do którego może przyłączyć się polimeraza DNA – enzym syntetyzujący nową nić na matrycy DNA. W reakcji PCR używa się termostabilnych polimeraz, takich jak polimeraza Taq (z bakterii Thermus aquaticus), która wykazuje maksymalną aktywność w temp. 75–80°C.  Jest to szczególnie ważna cecha – denaturację DNA w reakcji PCR osiąga się przez ogrzanie mieszaniny do temperatury 95–98°C, a więc takiej, w której inne polimerazy ulegają inaktywacji. Podczas syntezy nowych nici DNA polimeraza wykorzystuje nukleotydy, które dostarczone są w postaci mieszaniny. Mieszanina ta często opisywana jest jako dNTP (trifosforany deoksyrybonukleozydowetrifosforany deoksyrybonukleozydowetrifosforany deoksyrybonukleozydowe), a w jej skład wchodzą: dATP, dGTP, dCTP oraz dTTP, odpowiadając kolejno: nukleotydowi adeninowemu, guaninowemu, cytozynowemu i tyminowemu. 

Przebieg PCR

Reakcja PCR składa się z trzech etapów:

• denaturacji,

• przyłączania starterów,

• elongacji (wydłużania) nici.

Wszystkie trzy etapy powtarza się cyklicznie (zazwyczaj od 25 do 35 razy). Ponieważ każda nowa nić staje się matrycą w kolejnym cyklu, liczba kopii DNA rośnie wykładniczo. W efekcie w ciągu krótkiego czasu można otrzymać miliony identycznych fragmentów DNA, o długości wyznaczonej przez startery.

Zalety i wady PCR

Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera

Sekwencjonowanie DNA jest jedną z podstawowych metod genetyki molekularnej, polegającą na odczytywaniu kolejności nukleotydów w nici DNA. 

Sekwencjonowanie DNA przeprowadza się kilkoma metodami. Jedną z nich jest metoda enzymatyczna, znana również jako metoda Sangera (od nazwiska jej twórcy, Fredericka Sangera) lub metodą terminacji łańcucha. Pomimo upływu lat, po licznych modyfikacjach, technika ta jest z powodzeniem stosowana do dziś. 

Cechą charakterystyczną metody Sangera  jest wykorzystanie dideoksynukleotydów (ddNTP), które pełnią rolę „stoperów” podczas tworzenia nowej cząsteczki DNA. Są to tzw. nukleotydy terminalne. W odróżnieniu od deoksyrybonukleotydów (dNTP), które posiadają grupę 3’-OH umożliwiającą przyłączenie kolejnego nukleotydu, dideoksynukleotydy nie zawierają tej grupy. W rezultacie, gdy polimeraza DNA wbuduje ddNTP zamiast zwykłego nukleotydu, wydłużanie nici zostaje zakończone. Powstaje wówczas zbiór fragmentów DNA o różnych długościach, z których każdy kończy się określonym ddNTP.

W klasycznej metodzie Sangera stosowano cztery oddzielne reakcje, każda w osobnej probówce. Każda zawierała jednoniciową matrycę DNA, starter, polimerazę DNA, cztery rodzaje dNTP oraz niewielką ilość jednego rodzaju ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP albo ddTTP. W wyniku reakcji uzyskiwano zbiór fragmentów DNA o różnej długości, zakończonych odpowiednim dideoksynukleotydem. Fragmenty te rozdzielano za pomocą elektroforezy żelowej. Analiza kolejności prążków pozwala określić sekwencję badanego DNA.

We współczesnym sekwencjonowaniu Sangera reakcję przeprowadza się zwykle w jednej mieszaninie zawierającej cztery rodzaje ddNTP znakowane różnymi fluoroforami. Produkty rozdziela się metodą elektroforezy kapilarnej, a wynik sekwencjonowania przedstawia się w postaci chromatogramu. Każdy kolorowy pik odpowiada jednemu nukleotydowi w odczytywanej sekwencji.

Ciekawostka

RKwQZ9MxlunNB1

Zdjęcie przedstawia laboratorium. Po lewej stronie widoczne jest dygestorium, po prawej regał z ponumerowanymi książkami.

Mitochondrialny genom człowieka zsekwencjonowano już w 1981 r., co przyczyniło się do podjęcia próby poznania sekwencji całego genomu człowieka. Wyniki Projektu poznania ludzkiego genomu (ang. Human Genome Project), trwającego od 1990 do 2003 r., opublikowano w 2001 r. Poznanie sekwencji genomu nie stanowiło jednak zakończenia całego procesu. Następnym zadaniem było udzielenie odpowiedzi na pytanie o rolę danych sekwencji, a także ich wpływ na funkcjonowanie genomu. Badania te prowadzone są nadal.

Wektory i klonowanie DNA

Klonowanie DNA to proces polegający na namnożeniu (powieleniu) danego fragmentu DNA w komórkach, zwykle bakterii Escherichia coli, przy zastosowaniu specjalnego nośnika DNA – wektora genetycznego.

Wektory genetyczne

Wektor genetyczny to cząsteczka DNA służąca do wprowadzania wybranego fragmentu DNA do komórki. Wektorami mogą być m.in. plazmidy i odpowiednio zmodyfikowane wirusy.

Wektor połączony z fragmentem DNA, który ma zostać skopiowany  (najczęściej zawierający konkretny gen lub geny) tworzy cząsteczkę zrekombinowanego DNA.

R1TSApnbdDqNO

Schemat przedstawia powstawanie wektora plazmitowego. Pierwsza ilustracja obrazuje ludzką komórkę o okrągłym kształcie. W środku jej znajduje się jądro komórkowe w postaci pomarańczowego okręgu, w środku w nim znajduje się zwinięta nić DNA w kolorze czerwonym. Barwą żółtą zaznaczony jest jeden fragment nici - jest to gen kodujący insulinę. Poniżej znajduje się plazmid w kształcie ringu. Na kolejnej ilustracji plazmid ma z usunięty fragmentem. Na jego miejsce wszczepiono z kolei gen kodujący insulinę. Trzecia ilustracja pokazuje zrekombinowany DNA, już z wszczepionym fragmentem.

Aby cząsteczka DNA mogła być wektorem genetycznym musi zawierać:

• miejsce rozpoczęcia replikacji, dzięki któremu może być kopiowana w komórce;

• miejsca umożliwiające wprowadzenie wstawki;

• marker selekcyjnymarker selekcyjnymarker selekcyjny, pozwalający na selekcję komórek gospodarza zawierających wektor.

Klonowanie DNA

Do przeprowadzenia klonowania DNA niezbędne są:

• docelowy fragment DNA zawierający gen, który ma zostać powielony (sklonowany) do komórki;

• wektor genetyczny – służący jako nośnik fragmentu DNA przeznaczonego do sklonowania;

• enzymy restrykcyjne – służące do wycięcia wybranego fragmentu DNA z genomu organizmu, z którego zostanie pobrany, oraz przecięcia wektora, np. plazmidu; enzymy te rozpoznają swoiste sekwencje w dwuniciowej cząsteczce DNA, nazywane miejscami restrykcyjnymi, i przecinają DNA w danym miejscu;

• ligaza – enzym umożliwiający połączenie wyciętego fragmentu DNA z DNA wektora;

• gen selekcyjny – znacznik pokazujący, czy procedura się powiodła.

Etapy klonowania DNA

Klonowanie DNA można podzielić na dwa etapy:

1. otrzymanie zrekombinowanego DNA poprzez wyizolowanie określonego genu i przeniesienie go do wektora;

2. wprowadzenie wektora ze wstawionym genem do wybranej komórki i powielenie go na skutek replikacji.

Po zakończeniu klonowania DNA przeprowadza się selekcję, czyli wyodrębnienie bakterii, które przyjęły zrekombinowany plazmid wraz z genem selekcyjnym zapewniającym oporność na antybiotyk, od tych, które go nie mają. Po przeprowadzonej transformacji bakterie posiewa się na płytki z podłożem selekcyjnym z antybiotykiem. Bakterie bez plazmidu zginą; te zaś, które zyskały dzięki nowym genom antybiotykooporność, będą rosnąć na pożywkach  z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku, tworząc małe kolonie. Każda z nich będzie zawierać taki sam zrekombinowany plazmid z klonowanym fragmentem DNA.

Aby się upewnić, że uzyskane kolonie mają plazmid o prawidłowej strukturze, sprawdzane są pod kątem obecności zrekombinowanego genu. W tym celu wykorzystuje się reakcję PCR przeprowadzaną na wyizolowanych plazmidach z kilku kolonii lub trawienie za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. O obecności klonowanego DNA świadczy uzyskanie fragmentów DNA o określonej długości.

Biblioteki genowe

Biblioteki genowe (biblioteki DNA) są zbiorami sklonowanych fragmentów DNA przechowywanych w odpowiednich wektorach genetycznych i komórkach gospodarzy. Mogą one reprezentować cały genom organizmu lub zestaw genów aktywnych w określonym typie komórek.

Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje bibliotek genowych:

• biblioteki genomowe – zawierają fragmenty całego genomu organizmu, obejmujące zarówno geny, jak i sekwencje niekodujące. Powstają przez klonowanie fragmentów DNA genomowego, pochodzącego z chromosomów oraz DNA organelli komórkowych;

• biblioteki cDNA – zawierają kopie DNA (cDNA) otrzymane na matrycy cząsteczek mRNA w procesie odwrotnej transkrypcji. Reprezentują one geny aktywne w danej komórce lub tkance w momencie izolacji RNA.

Biblioteki genowe są wykorzystywane do wyszukiwania, identyfikacji i izolacji określonych genów oraz do badania budowy i funkcjonowania genomów. Stanowią również ważne źródło materiału do analiz genetycznych i biotechnologicznych. Oprócz bibliotek genowych istnieją także bazy danych sekwencji DNA oraz biobanki przechowujące materiał biologiczny i związane z nim informacje genetyczne.

Tworzenie bibliotek genomowych

Tworzenie biblioteki genomowej rozpoczyna izolacja DNA genomowego (gDNA) danego organizmu. Wyizolowane gDNA zostaje poddane trawieniu restrykcyjnemu za pomocą enzymów restrykcyjnych. Wolne końce uzyskanych w ten sposób fragmentów DNA łączone są z wektorem genetycznym ligazą DNA. Następnie stworzone wektory wprowadzane są do komórek bakteryjnych lub drożdżowych. Komórki te, dzieląc się, powielają wprowadzony do nich fragment DNA. Bardzo ważne jest, aby dany wektor zawierał wyłącznie jeden fragment DNA genomowego – jednak ze względu na losowość cięcia enzymami restrykcyjnymi fragmenty DNA w różnych komórkach mogą się na siebie nakładać.

Tworzenie bibliotek cDNA

Tworzenie biblioteki cDNAcDNAcDNA przebiega podobnie do tworzenia bibliotek genomowych, jednak wymaga innego przygotowania materiału do klonowania. W pierwszej kolejności niezbędna jest izolacja mRNA z komórek, tkanek lub całego organizmu. Ze względu na brak możliwości bezpośredniego połączenia wyizolowanego mRNA z DNA wektorów, niezbędne jest „przepisanie” mRNA na cDNA. Można tego dokonać dzięki enzymowi – odwrotnej transkryptazie – zdolnemu do syntezy nici DNA na bazie mRNA. Synteza drugiej nici zachodzi dzięki polimerazie DNA. Tak otrzymane dwuniciowe DNA, po modyfikacji poddaje się trawieniu restrykcyjnemu. Kolejne etapy przebiegają analogicznie jak przy tworzeniu bibliotek genomowych.

Biblioteki cDNA stanowią zgromadzone w wektorach i umieszczone w komórce bakterii cDNA, które ogranicza się wyłącznie do genów aktywnych transkrypcyjnie - nie zawierają intronów, dlatego tworzone wektory mogą być wykorzystywane w procesach klonowania genów eukariotycznych.

Podsumowanie

• Inżynieria genetyczna rozwinęła się wraz z postępem biologii molekularnej i umożliwia bezpośrednią ingerencję w DNA, w tym izolowanie, modyfikowanie, klonowanie i analizę genów oraz kontrolę ich ekspresji.

• Podstawowymi narzędziami biotechnologii molekularnej są enzymy:
  - polimerazy DNA  katalizują syntezę DNA na matrycy DNA; niektóre, takie jak odwrotna transkryptaza, wykorzystują jako matrycę RNA; są kluczowe w reakcji PCR i analizie ekspresji genów;

  - enzymy restrykcyjne – tną DNA w ściśle określonych sekwencjach, umożliwiając otrzymywanie fragmentów DNA, tworzenie rekombinowanego DNA oraz map restrykcyjnych;
  - ligazy DNA – łączą fragmenty DNA poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych, co pozwala na wstawianie genów do wektorów.

• Analiza restrykcyjna polega na trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi i identyfikacji powstałych fragmentów na podstawie ich długości; umożliwia sprawdzenie obecności i orientacji wstawki DNA w plazmidzie.

• Elektroforeza DNA jest techniką rozdziału fragmentów DNA w polu elektrycznym; pozwala porównywać długość fragmentów DNA na podstawie ich migracji w żelu i wizualizacji prążków.

• Hybrydyzacja DNA wykorzystuje sondy molekularne do wykrywania komplementarnych sekwencji DNA lub RNA; obejmuje m.in. metody Southern blot, Northern blot, FISH oraz mikromacierze DNA.

• Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) umożliwia szybkie i wielokrotne powielanie wybranego fragmentu DNA; znajduje zastosowanie w diagnostyce medycznej, kryminalistyce, biologii molekularnej i biotechnologii.

• Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera pozwala na odczytanie kolejności nukleotydów w DNA; jest wykorzystywane w badaniach naukowych, diagnostyce chorób genetycznych i nowotworowych.

• Klonowanie DNA polega na namnażaniu fragmentów DNA w komórkach gospodarza z użyciem wektorów genetycznych (np. plazmidów); może prowadzić do powstania rekombinowanego DNA.

• Biblioteka genomowa - jest zbiorem sklonowanych fragmentów całego genomu organizmu; zawiera zarówno geny kodujące, jak i sekwencje niekodujące. Stosowana jest m.in. do badań struktury genomu i lokalizacji genów.

• Biblioteka cDNA - jest zbiorem sklonowanych fragmentów DNA powstałych na podstawie mRNA wyizolowanego z określonej tkanki lub komórek; nie zawiera intronów, ponieważ cDNA powstaje z dojrzałego mRNA przy udziale odwrotnej transkryptazy. Jest wykorzystywana m.in. do analizy ekspresji genów oraz produkcji białek w organizmach prokariotycznych.

• Biblioteki genomowe i biblioteki cDNA stanowią zbiory sklonowanych fragmentów DNA i są podstawowym źródłem do identyfikacji, izolacji i analizy genów, w tym genów aktywnych transkrypcyjnie.

• Techniki inżynierii genetycznej mają kluczowe znaczenie w medycynie, biotechnologii, przemyśle i nauce, umożliwiając rozwój diagnostyki, terapii oraz badań nad funkcją genów

Ćwiczenia utrwalające