Streszczenie wątku 17

Biotechnologia i jej rodzaje

Biotechnologia to interdyscyplinarna dziedzina wykorzystująca organizmy, ich komórki, enzymy i procesy biologiczne do otrzymywania produktów oraz prowadzenia procesów przydatnych człowiekowi.

Wyróżnia się:

• biotechnologię tradycyjną – wykorzystuje organizmy o naturalnych cechach i ich procesy metaboliczne, bez stosowania inżynierii genetycznej;

• biotechnologię molekularną – wykorzystuje biologię molekularną i inżynierię genetyczną do analizowania oraz modyfikowania DNA. 

Biotechnologia tradycyjna znajduje zastosowanie w:

• produkcji pieczywa, serów, kiszonek, jogurtów i napojów alkoholowych;

• produkcji niektórych antybiotyków;

• selekcji roślin i zwierząt;

• biologicznym oczyszczaniu ścieków;

• biodegradacji zanieczyszczeń oraz produkcji biogazu i biopaliw.

Biotechnologia molekularna umożliwia tworzenie organizmów zmodyfikowanych genetycznie (GMO), produkcję białek leczniczych i szczepionek, diagnostykę molekularną, badanie funkcji genów oraz prowadzenie terapii genowej. Jej zastosowania wymagają oceny bezpieczeństwa oraz regulacji prawnych.

Narzędzia inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna obejmuje metody izolowania, analizowania, powielania, modyfikowania i przenoszenia fragmentów DNA.

Najważniejsze enzymy wykorzystywane w inżynierii genetycznej to:

• polimeraza DNA – syntetyzuje nić DNA na matrycy DNA;

• odwrotna transkryptaza – syntetyzuje DNA na matrycy RNA, umożliwiając otrzymanie cDNA;

• restryktazy – rozpoznają określone sekwencje i przecinają DNA;

• ligazy DNA – łączą fragmenty DNA.

Restryktazy mogą tworzyć lepkie końce, zawierające komplementarne odcinki jednoniciowe, lub tępe końce. Połączenie fragmentów DNA pochodzących z różnych źródeł prowadzi do powstania rekombinowanego DNA.

RwBBGxwCKxGO4

Ilustracja przedstawia przecięcie DNA enzymami restrykcyjnymi. Na ilustracji rozpisano naprzeciwległe fragmenty nici DNA. Przykład pierwszy. Nić o końcach oznaczonych jako pięć prim (lewy koniec), trzy prim (prawy koniec) ma zapis CCCGGG, poniżej jest nić oznaczona jako trzy prim (lewy koniec), pięć prim (prawy koniec) GGGCCC. Nożyczki przecinają nici na pół, pozostaje: w pierwszej nici CCC i osobno GGG, w drugiej nici GGG i osobno CCC. Pod zapisem napis: tępe końce. Przykład drugi. Pierwsza nić ma zapis GAATTC, druga nić CTTAAG. Nożyczkami w pierwszej nici (pięć prim - trzy prim) odcięto początkowe G, w drugiej (trzy prim - pięć prim) końcowe G. W wyniku przecięcia w pierwszej nici DNA G jest oddzielone od AATTC, w drugiej CTTAA jest oddzielone od końcowego G. Pod spodem jest napis: lepkie końce.

Wektor genetyczny to cząsteczka DNA służąca do wprowadzania obcego DNA do komórki. Wektorem może być plazmid lub odpowiednio zmodyfikowany wirus. Powinien zawierać miejsce rozpoczęcia replikacji, miejsce wprowadzenia wstawki oraz marker selekcyjny.

Analiza DNA

Analiza restrykcyjna i elektroforeza DNA

Analiza restrykcyjnapolega na przecięciu DNA restryktazami i określeniu długości uzyskanych fragmentów. Pozwala sprawdzić obecność i orientację wstawki w wektorze oraz wykrywać mutacje zmieniające miejsca restrykcyjne.

Elektroforeza żelowa rozdziela fragmenty DNA według długości. DNA ma ładunek ujemny, dlatego przemieszcza się w stronę anody. Krótsze fragmenty poruszają się szybciej i wędrują dalej niż dłuższe. Po rozdziale są widoczne jako prążki, których położenie porównuje się z markerem długości DNA. Fragmenty tej samej długości tworzą wspólny prążek.

Hybrydyzacja

Sonda molekularna to znakowany, jednoniciowy fragment DNA lub RNA, który łączy się (hybrydyzuje) z komplementarną sekwencją w badanej próbce.

Najważniejsze metody:

• Southern blot – wykrywanie określonych sekwencji DNA;

• Northern blot – wykrywanie określonych cząsteczek RNA;

• FISH – lokalizowanie sekwencji DNA w chromosomach lub jądrach komórkowych;

• mikromacierze – jednoczesna analiza ekspresji wielu genów.

Hybrydyzację stosuje się w diagnostyce chorób, badaniu aktywności genów, ustalaniu pokrewieństwa i wykrywaniu GMO.

Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) 

PCR umożliwia szybkie powielenie wybranego fragmentu DNA. Mieszanina reakcyjna zawiera matrycowe DNA, dwa startery, termostabilną polimerazę DNA, nukleotydy i bufor.

Jeden cykl PCR obejmuje:

1. denaturację – rozdzielenie nici DNA;

2. przyłączanie starterów do matrycy;

3. elongację – syntezę nowych nici przez polimerazę.

Powtarzanie cykli powoduje wykładniczy wzrost liczby kopii DNA. PCR wykorzystuje się w diagnostyce chorób, wykrywaniu mutacji i mikroorganizmów, genotypowaniu, ustalaniu pokrewieństwa i analizie śladów biologicznych. Duża czułość metody zwiększa ryzyko błędnego wyniku po zanieczyszczeniu próbki obcym DNA.

Sekwencjonowanie Sangera

Sekwencjonowanie DNA polega na ustalaniu kolejności nukleotydów. W metodzie Sangera wykorzystuje się znakowane dideoksynukleotydy, które nie mają grupy 3′-OH. Ich wbudowanie zatrzymuje syntezę nici DNA. Powstające fragmenty różnej długości są rozdzielane, a ich kolejność pozwala odczytać badaną sekwencję.

Wynik współczesnego sekwencjonowania przedstawia się jako chromatogram. Metodę stosuje się m.in. do wykrywania mutacji, diagnostyki chorób, identyfikacji mikroorganizmów i ustalania pokrewieństwa

Klonowanie DNA i biblioteki genowe

Klonowanie DNA polega na namnażaniu wybranego fragmentu DNA w komórkach gospodarza. Obejmuje:

1. wyizolowanie fragmentu DNA;

2. przecięcie wstawki i wektora restryktazą;

3. połączenie ich za pomocą ligazy;

4. wprowadzenie wektora do komórek;

5. selekcję komórek zawierających wektor;

6. namnożenie komórek i kontrolę poprawności wstawki.

Klonowanie DNA stosuje się w badaniu genów, produkcji białek, tworzeniu organizmów transgenicznych, produkcji szczepionek i terapii genowej. 

Biblioteka genomowa zawiera sklonowane fragmenty całego genomu, w tym geny i sekwencje niekodujące. Biblioteka cDNA powstaje na podstawie mRNA i zawiera kopie genów aktywnych w badanych komórkach. Nie zawiera intronów, dlatego może być wykorzystywana do produkcji białek eukariotycznych w bakteriach.

Organizmy zmodyfikowane genetycznie (GMO)

GMO to organizm, którego genom zmieniono metodami inżynierii genetycznej. Modyfikacja może polegać na wyciszeniu, zmianie lub zwiększeniu aktywności genu albo wprowadzeniu nowego genu (nazywanego transgenem).

Organizm transgeniczny jest GMO zawierającym gen pochodzący od innego gatunku. Wprowadzenie DNA prowadzące do trwałej zmiany genomu nazywa się transformacją genetyczną. Do wykrywania zmodyfikowanych komórek służą markery selekcyjne (np. geny oporności na antybiotyki) i geny reporterowe (np. gen białka zielonej fluorescencji - GFP).

Wykorzystanie GMO

Zmodyfikowane mikroorganizmy wykorzystuje się do produkcji insuliny, hormonu wzrostu, szczepionek, witamin, antybiotyków, enzymów, aminokwasów i barwników. Mogą również rozkładać zanieczyszczenia.

Rośliny GMO otrzymuje się metodami wektorowymi, np. z użyciem bakterii Agrobacterium, oraz bezwektorowymi, np. przez mikrowstrzeliwanie. Mogą wykazywać odporność na herbicydy, szkodniki, patogeny, suszę i zasolenie, mieć większą wartość odżywczą lub produkować substancje lecznicze.

Zwierzęta GMO otrzymuje się m.in. przez mikroiniekcję DNA do przedjądrza zygoty. Służą jako modele chorób, źródła białek leczniczych i potencjalne źródła narządów do przeszczepów.

Potencjalne korzyści GMO to poprawa cech użytkowych organizmów, produkcja leków, zwiększenie wartości odżywczej żywności i ochrona środowiska. Zagrożenia obejmują przepływ transgenów do populacji dzikich, powstawanie odpornych chwastów lub szkodników, zmniejszenie bioróżnorodności, możliwość powstania nowych alergenów oraz skutki ekonomiczne i etyczne.

Klonowanie organizmów

Klonowanie organizmów prowadzi do otrzymywania osobników o zasadniczo takim samym genomie jądrowym, bez rekombinacji związanej z rozmnażaniem płciowym. Naturalnymi klonami są m.in. organizmy powstałe przez podział, pączkowanie i rozmnażanie wegetatywne oraz bliźnięta jednojajowe.

Klony nie są całkowicie identyczne fenotypowo. Mogą różnić się wskutek mutacji, zmian epigenetycznych, odmiennego mitochondrialnego DNA oraz wpływu środowiska.

Klonowanie roślin

Podstawową metodą klonowania roślin jest mikrorozmnażanie, które polega na regeneracji roślin z komórek lub tkanek hodowanych na pożywkach. W procedurze tej na pożywkę wykłada się fragment rośliny, z którego najczęściej przy użyciu fitohormonów indukuje się najpierw tkankę kalusową, a z niej pędy. Po ich ukorzenieniu - również przy udziale fitohormonów - uzyskuje się rośliny, które przenosi się do z. Mikrorozmnażanie umożliwia szybkie otrzymywanie licznych roślin o pożądanych cechach, rozmnażanie rzadkich gatunków i produkcję roślin wolnych od patogenów. 

R1QOP0Ef0rx1T

Na ilustracji znajduje się tkanka kalusowa tytoniu szlachetnego. Znajduje się w przezroczystej, okrągłej podstawce, ma postać grudkowatej, zielonej masy.

Klonowanie zwierząt 

Stosuje się:

• rozdział wczesnego zarodka – oddzielone totipotencjalne blastomery rozwijają się w odrębne zarodki;

• transfer jądra komórki somatycznej – jądro komórki somatycznej dawcy wprowadza się do komórki jajowej pozbawionej własnego jądra.

Klonowanie zwierząt stosuje się w hodowli, badaniach i ochronie gatunków. Ma jednak niską wydajność i wiąże się z dużą śmiertelnością zarodków oraz zaburzeniami rozwojowymi klonów. Klonowanie reprodukcyjne człowieka jest w Polsce zakazane.

Diagnostyka i poradnictwo genetyczne

Diagnostyka molekularna wykorzystuje analizę DNA lub RNA do wykrywania mutacji oraz sekwencji związanych z chorobami. Stosuje PCR, sekwencjonowanie, analizę restrykcyjną i hybrydyzację.

Wyróżnia się:

• testy diagnostyczne – potwierdzają lub wykluczają chorobę;

• testy prognostyczne – oceniają ryzyko zachorowania;

• badania nosicielstwa – wykrywają allele mogące zostać przekazane potomstwu.

Poradnictwo genetyczne obejmuje analizę historii rodzinnej, ocenę ryzyka wystąpienia choroby oraz interpretację wyników badań. Ryzyko wystąpienia choroby ocenia się osobno dla każdego potomka — wynik wcześniejszej ciąży go nie zmienia.

Terapia genowa

Terapia genowa polega na modyfikacji materiału genetycznego komórek pacjenta w celu leczenia choroby. Może obejmować wprowadzenie prawidłowej kopii genu, wyciszenie genu działającego nieprawidłowo albo skierowanie określonych komórek na drogę apoptozy.

• Terapia ex vivo – komórki pobiera się od pacjenta, modyfikuje w laboratorium i ponownie wprowadza do organizmu.

• Terapia in vivo – terapeutyczny materiał genetyczny dostarcza się bezpośrednio do organizmu.

Wektorami mogą być zmodyfikowane wirusy lub liposomy. Ograniczenia terapii obejmują możliwość reakcji immunologicznej, niepożądane miejsce integracji DNA, nietrwałą ekspresję genu, ograniczoną skuteczność i wysokie koszty. Somatyczna terapia genowa nie powoduje dziedziczenia modyfikacji przez potomstwo.

Komórki macierzyste 

Komórki macierzyste są zdolne do samoodnowy i różnicowania w komórki wyspecjalizowane.

Wyróżnia się:

• totipotencjalne – mogą utworzyć cały organizm wraz ze strukturami pozazarodkowymi;

• pluripotencjalne – mogą utworzyć niemal wszystkie typy komórek ciała;

• multipotencjalne – tworzą kilka spokrewnionych typów komórek;

• unipotencjalne – różnicują się w jeden typ komórek.

Komórki iPSC powstają przez przeprogramowanie komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego.

Komórki macierzyste pozyskuje się m.in. z zarodków, szpiku kostnego, krwi pępowinowej, łożyska oraz tkanek organizmu dorosłego. Stosuje się je w leczeniu niektórych chorób krwi, odtwarzaniu naskórka i regeneracji rogówki. Wykorzystanie komórek embrionalnych budzi kontrowersje etyczne związane ze zniszczeniem zarodka.

Profil genetyczny i określanie pokrewieństwa

Profil genetyczny tworzy się przede wszystkim na podstawie sekwencji STR, których liczba powtórzeń różni się między osobami.

Ustalenie profilu obejmuje:

1. zabezpieczenie materiału biologicznego;

2. izolację DNA;

3. namnożenie markerów metodą PCR;

4. rozdzielenie fragmentów według długości;

5. porównanie profili;

6. analizę statystyczną wyniku.

Profile genetyczne służą do identyfikacji sprawców, ofiar, osób zaginionych i szczątków oraz do ustalania pokrewieństwa i ojcostwa. Mitochondrialne DNA dziedziczy się w linii matczynej, dlatego nie służy ono do ustalania ojcostwa. 

Pokrewieństwo organizmów ustala się również przez porównywanie homologicznych sekwencji DNA, RNA i białek. Wiarygodne wnioskowanie powinno opierać się na wielu markerach lub całych genomach. Wyniki wykorzystuje się do identyfikacji organizmów i konstruowania drzew filogenetycznych.

Szanse i zagrożenia biotechnologii 

Najważniejsze korzyści biotechnologii to:

• rozwój diagnostyki, leków, szczepionek i terapii genowych;

• produkcja białek leczniczych;

• rozwój medycyny regeneracyjnej;

• ulepszanie organizmów użytkowych;

• identyfikacja osób i ustalanie pokrewieństwa;

• biologiczne usuwanie zanieczyszczeń.

Najważniejsze zagrożenia i problemy:

• nieprzewidziane skutki modyfikacji genetycznych;

• przepływ transgenów i zmniejszenie bioróżnorodności;

• powstawanie oporności chwastów, szkodników i mikroorganizmów;

• możliwość powstawania alergenów;

• dobrostan zwierząt doświadczalnych;

• wykorzystywanie i niszczenie zarodków;

• nierówny dostęp do kosztownych terapii;

• naruszanie prywatności danych genetycznych;

• możliwość dyskryminacji i niewłaściwego wykorzystania technologii.

Ocena konkretnego zastosowania biotechnologii powinna uwzględniać spodziewane korzyści, ryzyko zdrowotne i środowiskowe, dostępne rozwiązania alternatywne oraz aspekty prawne i etyczne.