Analiza ilościowa produktów leczniczych
Do metod klasycznych stosowanych w analizie leków należy analiza wagowa i analiza objętościowa, czyli miareczkowa. Instrumentalna analiza ilościowa opiera się na metodach spektrofotometrycznych i chromatograficznych, rzadziej wykorzystywane są metody elektroanalityczne. Podział metod analizy ilościowej leków przedstawiono na rycinie 5.
![Schemat przedstawiający metody analizy jakościowej. Nagłówek. Metody analizy jakościowej. Metody klasyczneAnaliza wagowaAnaliza miareczkowa <ol start="1" data‑editor‑list‑style="lower‑alpha">Metody alkacymetryczneMetody redoksymetryczneMetody strącenioweMetody kompleksometryczneMetody instrumentalne Metody spektrometryczne<ol start="1" data‑editor‑list‑style="lower‑alpha">AbsorpcyjneSpektrofotometria w nadfiolecieSpektrofotometria w zakresie widzialnymAtomowa spektroskopia absorpcyjnaMetody emisyjneFluorometriaMetody radiometryczneMetody chromatograficzne<ol start="1" data‑editor‑list‑style="lower‑alpha">Chromatografia cieczowaChromatografia gazowaElektroforeza Metody elektroanalityczne <ol start="1" data‑editor‑list‑style="lower‑alpha">PotencjometriaMiareczkowanie potencjometryczne, amperometryczne i konduktometryczne](https://static.zpe.gov.pl/portal/f/res-minimized/RwWdWf3VoD5g1/1674849103/1O3O46wFaqQIsbTjUnkQZUgePrurWwrO.jpg)
Metoda wagowa (grawimetryczna) polega na określeniu masy oznaczanej substancji (analitu) przeprowadzanej w trudno rozpuszczalny związek za pomocą odpowiedniego odczynnika strącającego. Wydzielony z roztworu osad powinien być praktycznie nierozpuszczany w danym środowisku. Osad jest ważony po wysuszaniu lub prażeniu.
Analiza miareczkowa polega na oznaczaniu składnika w badanym roztworze za pomocą odczynnika miareczkującego (titranta) o znanym stężeniu (mianie), który odmierzany jest dokładnie za pomocą biurety. Punkt końcowy miareczkowania określa się wizualnie, wykorzystując barwne wskaźniki, które zmieniają barwę w punkcie równoważnikowym reakcji. Zmiana zabarwienia może odbywać się pod wpływem zmiany pH miareczkowanego roztworu, zmiany potencjału redoks lub poprzez reakcję chemiczną samego wskaźnika z nadmiarem titranta.
![Grafika przedstawiająca etapy miareczkowania. Odpowiednia objętość rozpuszczalnika zostaje dodana za pomocą szklanej pipety do próbki znajdującej się w kolbie. Następnie wskaźnik jest dodawany do mieszaniny za pomocą kroplomierza. Na górze kolby umieszczana jest biureta z zamkniętym zaworem, po czym zawór zostaje otwarty powodując powolne dodawanie titranta do roztworu w kolbie. W momencie osiągnięcia punktu końcowego, w którym wskaźnik w roztworze zmienia zabarwienie, zawór zostaje zamknięty, a odczyt objętości titranta można odczytać ze skali umieszczonej na biurecie.](https://static.zpe.gov.pl/portal/f/res-minimized/RfLBVB7YoObSi/1674849103/1xh0YKVTG2ZWmcj5QnGU9xJiUpiVYyBY.jpg)
Metody miareczkowe można podzielić ze względu na typ miareczkowania na miareczkowanie bezpośrednie, miareczkowania odwrotne i miareczkowanie pośrednie. Gdy reakcja chemiczna między analitem a titrantem zachodzi szybko i można łatwo określić punkt końcowy miareczkowania, stosuje się miareczkowanie bezpośrednie. Przykładem takiego miareczkowania jest alkalimetryczne oznaczanie kwasu salicylowego w roztworze etanolowym wobec fenoloftaleiny, która w punkcie końcowym miareczkowania zabarwia bezbarwny roztwór na różowo.
![Grafika przedstawia równanie reakcji przebiegającej podczas miareczkowania kwasu salicylowego roztworem wodorotlenku sodu, N a O H. Jest to miareczkowanie bezpośrednie. Substratami reakcji są kwas salicylowy, a dokładniej kwas karboksylowy zawierający jedną grupę hydroksylową i jedną grupę karboksylową przyłączone do pierścienia benzenowego w układzie orto, oraz wodorotlenek sodu. Produktami reakcji są salicylan sodu, czyli sól sodowa kwasu salicylowego oraz woda.Do obliczeń związanych z oznaczaniem zawartości kwasu salicylowego wykorzystuje się następujące proporcje 1000 mililitrów roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 1 mol na 1 litr odpowiada masie molowej kwasu salicylowego.](https://static.zpe.gov.pl/portal/f/res-minimized/R19d7owrDeWvs/1674849104/PoS9vHVbMODycE1baM24lAxCpu3MfHrJ.jpg)
Gdy titrant reaguje z analitem powoli lub reakcja zachodzi po ogrzaniu, a także w sytuacji gdy odczynnik miareczkujący został dodany w nadmiarze, można zastosować miareczkowanie odwrotne. Wtedy do roztworu analitu dodaje się znaną ilość titranta w nadmiarze, czeka się lub podgrzewa roztwór, aby reakcja osiągnęła równowagę, następnie odmiareczkowuje nadmiar odczynnika odpowiednim, pomocniczym mianowanym roztworem, który reaguje szybko, stechiometrycznie z titrantem wobec odpowiedniego wskaźnika. Przykładem miareczkowania odwrotnego jest alkacymetryczne oznaczanie kwasu acetylosalicylowego przebiegające tak, jak przedstawiono na rycinie 8.
![Grafika przedstawia równanie reakcji przebiegającej podczas miareczkowania kwasu acetylosalicylowego roztworem wodorotlenku sodu, N a O H. Jest to miareczkowanie odwrotne. Najpierw przeprowadza się hydrolizę kwasu acetylosalicylowego. Kwas acetylosalicylowy, czyli acetylowa pochodna kwasu salicylowego, reaguje z wodorotlenkiem sodu, w wyniku tej reakcji powstaje salicylan sodu, czyli sól sodowa kwasu salicylowego, octan sodu oraz woda. Następnie pozostały wodorotlenek sodu odmiareczkowuje się kwasem siarkowym. W tej reakcji produktami są siarczan sodu oraz woda.Do obliczeń związanych z oznaczaniem zawartości kwasu acetylosalicylowego wykorzystuje się następujące proporcje 1000 mililitrów roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 1 mol na 1 litr odpowiada jednej drugiej masy molowej kwasu acetylosalicylowego.](https://static.zpe.gov.pl/portal/f/res-minimized/Rl6UqLs7qktdi/1674849104/7bz4z8TCoaG9vTU0tePutU4FrIZVT7Oj.jpg)
Nadmiar NaOH można odmiareczkować mianowanym roztworem kwasu siarkowego wobec fenoloftaleiny.
Ilościowe oznaczenia leczniczych substancji czynnych o charakterze kwasowym lub zasadowym wykonuje się często przez miareczkowanie alkacymetryczne, tzn. przez miareczkowanie mianowanymi roztworami kwasów (acydymetria) lub zasad (alkalimetria). Titrantami są roztwory silnych zasad lub kwasów, a oznaczanie przeprowadzane jest w środowisku wodnym lub niewodnym.
Za pomocą alkalimetrii w środowisku wodnym (lub etanolowym) oznaczane są leki o charakterze kwasów, np. kwas mlekowy, kwas salicylowy, kwas acetylosalicylowy, kwas p‑aminobenzoesowy, kwas mefenamowy, ibuprofen, indometacyna. Acydymetrycznie w środowisku niewodnym oznaczane są sole, np. pantotenian wapnia, diklofenak sodowy, benzoesan sodowy, chlorowodorek tiaminy, chlorowodorek ksylometazoliny. Miareczkowanie kwasem nadchlorowym prowadzi się w środowisku bezwodnego kwasu octowego. Punkt końcowy miareczkowania wyznacza się, używając naftolenobenzoiny, fioletu krystalicznego albo potencjometrycznie.
Metody redoksymetryczne oparte są na reakcji redoks. Można je podzielić na metody reduktometryczne, w których miareczkuje się odczynnikiem redukującym, i metody oksydymetryczne, gdy titrant ma właściwości utleniające. W analizie leków stosowane są zarówno metody oksydymetryczne, do których należą:
jodometria (np. jodometryczne oznaczanie kwasu askorbowego),
bromianometria (np. bromianometryczne oznaczanie izoniazydu),
ceromertia (np. cerometryczne oznaczanie paracetamolu),
jak i metody reduktometryczne, np. jodometria odwrotna, gdy nadmiar jodu odmiareczkowywany jest mianowanym roztworem tiosiarczanu sodu.
Przykładem miareczkowania strąceniowego jest argentometryczne oznaczanie leków o charakterze chlorowodorków i bromowodorków metodą Volharda. W badanym roztworze, w środowisku rozcieńczonego kwasu azotowego, strąca się chlorki przez dodanie mianowanego roztworu azotanu srebra w nadmiarze. Nadmiar azotanu srebra odmiareczkowuje się mianowanym roztworem rodanku amonu wobec soli żelaza(III).
![Grafika przedstawia równanie reakcji azotanu srebra z rodankiem amonu wykorzystywane podczas odmiareczkowywania nadmiaru azotanu srebra podczas oznaczania leków metodą Volharda. W wyniku tej reakcji dochodzi do strącenia rodanku srebra, drugim produktem reakcji jest azotan amonu.](https://static.zpe.gov.pl/portal/f/res-minimized/R17IYF6zd45g5/1674849104/1BUNcgs9dufCRVbBTllK2fA395Y7K2pu.jpg)
Po strąceniu całej ilości srebra pierwsza kropla rodanku tworzy z jonami żelaza(III) czerwony kompleks . Metodę tę można stosować do oznaczania np. bromowodorku fenoterolu, chlorowodorku prokainy, chlorowodorku lidokainy.
Metoda oparta na reakcji tworzenia kompleksów z jonami metali to kompleksometia, titrantem w tej metodzie jest mianowany roztwór edetynianu sodowego (EDTA). Kompleksometrycznie oznacza się sole magnezu, manganu i wapnia (np. glukonian wapnia, mleczan wapnia, siarczan magnezu, cytrynian magnezu). Miareczkowanie prowadzi się w środowisku zasadowym, stosując jako wskaźniki czerń eriochromową (sole magnezu i manganu) oraz sól sodową kwasu kalkonokarboksylowego (sole wapnia).
Metody instrumentalne wymagają odpowiedniej aparatury: spektrofotometru, chromatografu ze stosownym detektorem, aparatu do miareczkowania potencjometrycznego. Odczynniki i wzorce muszą być odpowiedniej czystości i przygotowanie próbek musi być zgodne z zaleceniami producentów aparatury.
Do pomiarów absorpcji promieniowania nadfioletowego i widzialnego (UV‑Vis) służą wyposażone w odpowiednie kuwety spektrofotometry. Pozwalają one na pomiar absorpcji promieniowania w zakresie 200–800 nm. Każdy związek leczniczy, który ma układ chromoforowy, czyli układ wiązań wielokrotnych (np. pierścień aromatyczny), może być oznaczany metodą spektrofotometrii w nadfiolecie.
Metodą spektrofotometryczną w zakresie widzialnym oznaczane są związki, które tworzą barwne kompleksy w reakcji o znanym przebiegu (kompleksy muszą być trwałe, a w reakcji nie może się tworzyć osad), np. salicylan sodu po reakcji chlorkiem żelaza(III) lub barbiturany po reakcji Parriego. Zasadą tej metody jest porównanie absorpcji barwnego roztworu powstałego w wyniku reakcji z substancją badaną z absorpcją barwnego roztworu powstałego w wyniku reakcji z substancją odniesienia, czyli roztworem badanej substancji o znanym stężeniu (przy określonej długości fali).
Absorpcyjna spektroskopia atomowa jest metodą używaną do oznaczania pierwiastków, więc zastosowanie ma w analizie ilościowej preparatów leczniczych zawierających związki cynku, miedzi, manganu, żelaza, magnezu, wapnia, a także w oznaczaniu zanieczyszczeń produktów leczniczych, zwłaszcza pochodzenia roślinnego, metalami ciężkimi: ołowiem i kadmem.
O metodach emisyjnych mówimy, gdy analizowane jest promieniowanie nie absorbowane, lecz emitowane przez próbkę. Do takich metod analizy należą metody radiometryczne, za pomocą których określa się aktywność radiofarmaceutyków.
Najważniejszą metodą w ilościowej analizie leków jest chromatografia. Ponieważ zasadą metody jest podział analitu między fazę ruchomą i stacjonarną, może być wykorzystywana do oznaczeń leków zarówno jednoskładnikowych, jak i wieloskładnikowych, a także jest bardzo ważnym narzędziem w określaniu czystości substancji leczniczej. Najczęściej stosowaną metodą jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) lub wysokosprawna/wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (UHPLC), a do oznaczania związków lotnych – chromatografia gazowa (GC).
Przykładem wykorzystywania metod elektroanalitycznych w analizie leków jest miareczkowanie potencjometryczne, w którym punkt końcowy miareczkowania wyznacza się przez pomiar zmian napięcia generowanego przez ogniwo, a nie za pomocą wskaźnika barwnego. Przykładem miareczkowania potencjometrycznego jest azotynometryczne oznaczanie leków zawierających I‑rzędową grupę aromatyczną (benzokaina, kwas 4‑aminibenzoesowy, ambroksol, prokaina).
W celu pogłębienia i ugruntowania tematu analizy jakościowej, można przejść do gry edukacyjnej „Od leku do wyniku”gry edukacyjnej „Od leku do wyniku”.
Powrót do spisu treściPowrót do spisu treści