Laboratorium 1

Temat doświadczenia: Hydroliza skrobi przez amylazy zawarte w ślinie.

Przeprowadzono doświadczenie dotyczące aktywności enzymatycznej śliny. Zaplanowano próbę kontrolną i zaobserwowano przebieg reakcji barwnej z płynem Lugola. Zanotowano czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy jodu – punkt achromowy. Podano aktywność amylazy w ślinie w jednostkach/ml. Uwaga: w tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjęto taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37°C, w pH 6,6 w obecności jonów chlorkowych do produktów niedających barwy z jodem (punkt achromowy).

Problem naukowy: Jakie substancje są hydrolizowane przez amylazy zawarte w ślinie?

Hipoteza: Amylazy zawarte w ślinie hydrolizują skrobię.

Próba kontrolna: Probówka zawierająca 5 ml skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, umieszczona w łaźni wodnej o temperaturze 37°C do której w odstępach czasu wyznaczonych dla próby badawczej dodawany jest płyn Lugola. 

Sprzęt laboratoryjny: statyw z probówkami, pipety, bagietki, łaźnia wodna z wodą o temperaturze 37°C.

Odczynniki: 0,5‑procentowy roztwór skrobi, bufor fosforanowy pH 6,6, 1‑procentowy roztwór NaCl, płyn Lugola, 1 M HCl, 1 M NaOH.

Instrukcja wykonania doświadczenia:

1. Przygotować statyw z probówkami zawierającymi po 0,5 ml odczynnika Lugola i 0,5 ml 1 M HCl. W kalibrowanej probówce (1) zebrać ok. 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37°C.

2. Do zwykłej probówki (2) odmierzyć 5 ml skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 5 minut.

3. Po 5 minutach do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać i ponownie wstawić do łaźni wodnej.

4. W krótkich odstępach czasu (od 30 s do 3 min) do probówek w statywie, zawierających płyn Lugola, wprowadzić pipetą próbki hydrolizatu z probówki (2).

Szczegóły doświadczenia 1. Bufor fosforanowy służy do utrzymania stałego pH w mieszaninie reakcyjnej.

Szczegóły doświadczenia 2. Utrzymanie temperatury 37°C jest niezbędne, ponieważ amylaza zawarta w ślinie, podobnie jak inne enzymy, wykazuje aktywność w konkretnej temperaturze.

Szczegóły doświadczenia 3. Wynik doświadczenia można zaobserwować dzięki płynowi Lugola, który barwi skrobię na niebiesko.

Obserwacje: Przebieg procesu degradacji skrobi można śledzić, obserwując zmianę barwy roztworu skrobi traktowanego jodem od niebieskiej (kompleks ze skrobią) do bezbarwnej (utworzenie cukrów o niskim ciężarze cząsteczkowym).

Wyniki: W czasie procesu rośnie zawartość cukrów redukujących i produktów hydrolizy skrobi. Określając ich zawartość, można śledzić przebieg reakcji.

Wnioski: Amylazy zawarte w ślinie hydrolizują wiązania glikozydowe w skrobi.