Wejdź na wyższy poziom

Klonowanie roślin metodą mikrorozmnażania

Poniżej został opisany przebieg mikrorozmnażania roślin na przykładzie skrętnika (Streptocarpus sp.) – rośliny ozdobnej pochodzącej z Afryki.

RBZf0LCVZyLCI

Na fotografii znajdują się fioletowe, drobne kwiaty. Każdy z nich posiada pięć płatków. Środek ma kolor ciemnofioletowy, trzy dolne, większe płatki są fioletowe, a obwódka każdego z płatków ma kolor jasnofioletowy. Kwiaty wyrastają z kępy zielonych, podłużnych liści. W tle znajduje się brązowo‑zielona skała.

Produkcja biofarmaceutyków w układach transgenicznych

Barkoding DNA

Identyfikacja organizmów i przypisywanie ich do odpowiednich taksonów to żmudny proces, wymagający dużego nakładu czasu oraz dokładności. W przeszłości jedną z technik stosowanych w badaniu pokrewieństwa była analiza fenotypowa, skupiająca się na cechach fenotypowych organizmów. Stworzone tą metodą drzewa filogenetyczne pozwalały na wstępne ustalenie gatunku danego organizmu. Jednak zostały one istotnie zmienione na podstawie wyników badań DNA.

Analiza fenotypowa związana jest z dużym prawdopodobieństwem błędu, ze względu na możliwość niezależnego wykształcenia się cech u różnych organizmów czy plastyczność fenotypu. Dzięki rozwojowi technik analizy kwasów nukleinowych, w tym sekwencjonowania, oraz wiedzy z zakresu budowy genomów, a także dzięki utworzeniu baz danych zawierających już poznane genomy możliwe stało się dokładne prześledzenie procesów ewolucji i ustalenie pokrewieństwa między gatunkami. W efekcie wiele organizmów zostało przeklasyfikowanych do innych taksonów.

Jedną z technik identyfikacji organizmu, które opierają się na analizie sekwencji kwasów nukleinowych, jest barkoding DNA.

Identyfikacja organizmu metodą barkodingu DNA

Ograniczenia w identyfikacji organizmów na podstawie ich morfologii spowodowały, że konieczne było opracowanie nowego systemu klasyfikacji, który obarczony jest niskim poziomem błędu, a także jest łatwy w wykorzystaniu oraz – co ważne – uniwersalny. Dzięki uniwersalności laboratoria na całym świecie mogą korzystać z tych samych rozwiązań, co pozwala na szybką wymianę danych i zapewnia wiarygodność ustaleń. Metodą, która spełnia wszystkie te wymagania, jest barkoding DNA. Opiera się ona na identyfikacji krótkich sekwencji DNA, zwanych barkodami. Ich analiza umożliwia szybką i wiarygodną identyfikację gatunków znanych, a także ustalenie klasyfikacji gatunków nowo odkrytych. Metoda ta pozwala rozróżnić gatunki bez względu na stadium rozwojowe.

System identyfikacji organizmów na podstawie barkodów został opracowany w 2003 r. przez Paula Heberta, kanadyjskiego naukowca. Technika ta jest podobna do identyfikacji towarów w sklepie na podstawie kodów kreskowych – barkody stanowią swoiste kody kreskowe DNA, a analiza ich sekwencji pozwala na rozpoznanie gatunku.

RMlEJXMxpXLLS

Ilustracja przedstawia cztery kolejne obrazki, pomiędzy którymi są strzałki. Na pierwszy obrazku jest zwierze ze szczypcami. Obok znajduje się probówka Eppendorfa. W probówce unoszą się bezkształtne zielono‑czerwone otoczki. Na kolejnej ilustracji jest urządzenie z płaską częścią z przodu i wyższą tylną częścią. Obok urządzenia jest probówka Eppendorfa. W probówce w płynie unoszą się czerwone laseczki. Na kolejnym obrazku są dwa rzędy pionowych kresek w kolorach: czarnym, zielonym, niebieskim, czerwonym. Nad rzędami są cztery krzywe z licznymi wahaniami - mają kolor czarny, czerwony, niebieski, zielony. Nad krzywymi w jednym rzędzie są litery w kolejności od lewej do prawej strony: T G A A C T T T C T, A. T jest czerwone, A jest zielone, G jest czarne, C jest niebieskie. Od obrazka strzałka w prawo do napisu Microbisium parvulum.

Barkody

Barkod, czyli sekwencja DNA wykorzystywana do identyfikacji organizmów, musi posiadać określone cechy:

• wykazywać się niską zmiennością w obrębie gatunków, równocześnie charakteryzując się wysoką zmiennością na poziomie międzygatunkowym;

• być krótkim odcinkiem DNA – sekwencja powinna zawierać ok. 600 par zasad;

• być otoczonym przez regiony o wysokim stopniu konserwacji;

• występować w wielu kopiach;

• występować w regionie, który nie może być miejscem częstych zmian w sekwencji DNA.

Ze względów technicznych bardzo ważne są cechy barkodu związane z jego długością, umiejscowieniem w genomie, a także liczbą kopii. Krótka sekwencja barkodu przyspiesza proces sekwencjonowania próbki. Jest to istotne zwłaszcza w przypadku prób środowiskowych, w których występuje wiele różnych gatunków. Z kolei niezmienność danego regionu w genomie pozwala na zaprojektowanie uniwersalnych dla gatunku starterów, umożliwiających powielenie DNA. Natomiast duża liczba kopii barkodu wpływa na dokładniejszą identyfikację organizmów z próbek zdegradowanych, pochodzących z materiałów kopalnych czy niewielkich fragmentów tkanek.

Przykłady stosowanych barkodów

\ Ze względu na ogromną różnorodność organizmów żywych nie jest możliwe wykorzystanie jednego, uniwersalnego barkodu. Inne sekwencje są stosowane do identyfikacji zwierząt, a inne w przypadku roślin czy grzybów.

Sekwencje barkodów rzadko pochodzą z genomu jądrowego – częściej stosowane są te zlokalizowane w genomie mitochondrialnym. W porównaniu z DNA mitochondrialnym, materiał genetyczny zawarty w jądrze komórkowym w większym stopniu podlega mechanizmom ochrony oraz naprawy DNA, przez co rzadziej dochodzi w nim do zmian. Barkody z DNA jądrowego miałyby także małą liczbę kopii, co mogłoby utrudnić identyfikację. Ponadto do zalet genomu mitochondrialnego należą jego sposób dziedziczenia (dziedziczenie uniparentalne – DNA mitochondrialny zwykle dziedziczony jest wyłącznie po matce) oraz brak sekwencji intronowych (sekwencji niekodujących, które nie skutkują powstaniem na ich bazie łańcucha aminokwasowego).

Barkody wykorzystywane u zwierząt

Przykładem wykorzystania sekwencji mitochondrialnych jako barkodów jest fragment genu CO1, odpowiedzialnego za kodowanie enzymu oksydaza cytochromu c. Sekwencja długości 648 par zasad została wstępnie porównana między różnymi organizmami – do analizowanej grupy należało 2238 różnych gatunków zwierząt. Między niektórymi z nich wykazano zaledwie 2% różnice. Nieco większe różnice uzyskano w obrębie parzydełkowców.

Analizę na podstawie barkodu oksydazy cytochromu c wykonano także dla grupy naczelnych. Różnica między ludźmi wyniosła od 1 do 2 par zasad. Natomiast między ludźmi i szympansami wykazano różnicę ok. 60 par zasad, a między ludźmi i gorylami – 70 par zasad. Wyniki te wskazują, że wśród naczelnych najbliżej spokrewnione z ludźmi są szympansy.

R1Ofr0Y7hdrPG

Ilustracja przedstawia trójwymiarową strukturę cytochromu c. Na ilustracji jest zielona nić w postaci fragmentów w kształcie spirali, połączonych z prostszymi odcinkami. W strukturze wyróżnia się cząsteczka hemu - ma połączonych ze sobą w kształt kwadratu czterech pięciokątów. W środku jest pomarańczowa kulka. Pięciokąty mają niebieskie fragmenty.

Barkody wykorzystywane u roślin

W przypadku roślin identyfikacja gatunków na podstawie fragmentów mitochondrialnego DNA nie jest możliwa. Wynika to z jego małej zmienności, związanej z wolnym tempem mutacji. Lepsze rezultaty uzyskiwane są z wykorzystaniem chloroplastowego DNA. Jako sekwencje barkodowe stosowane są fragmenty genów enzymu maturaza K, odpowiedzialnego za splicing intronów, oraz gen rbcl (karboksylaza/oksygenaza rybulozo‑1,5‑bisfosforanu), związany z fazą ciemną fotosyntezy.

Barkody wykorzystywane u bakterii

W celu identyfikacji bakterii wykorzystywana jest mała podjednostka rybosomalna 16S, która wykazuje wysoki poziom konserwacji ewolucyjnej. Inne markery dające obiecujące wyniki to m.in. gen rpoB, kodujący podjednostkę beta polimerazy RNA, czy cpn60, związany z fałdowaniem białek.

Barkody wykorzystywane u grzybów

Identyfikację grzybów przeprowadza się na podstawie genu oksydazy cytochromu c, jednak analiza ta nie daje dobrych wyników dla wszystkich grup. Istnieje zatem konieczność wykorzystania dodatkowych barkodów. Jednym z markerów jest rRNA związany z dużą podjednostką rybosomalną (28S).

Biblioteki barkodów

Identyfikacja organizmów często wymaga wykorzystania więcej niż jednego barkodu. Pomocnym narzędziem w analizie wyników barkodingu DNA są biblioteki barkodów – bazy danych z sekwencjami sprawdzonych barkodów. Pozwala to na szybkie porównanie uzyskanych sekwencji z tymi, które zostały zgromadzone w bazie, co umożliwia sprawną identyfikację gatunków. Gdy danej sekwencji brakuje w bibliotece, tworzony jest nowy wpis dla danego gatunku.

Jedną z największych baz danych gromadzących sekwencje barkodowe jest BoLD (ang. Barcode of Life Data System). Od momentu powstania tej biblioteki w 2007 r. zgromadzono w niej ponad 6 mln sekwencji. Są to głównie barkody uzyskane w wyniku analiz sekwencji fragmentu genu CO1 u zwierząt. Inna biblioteka, UNITE, zawiera dane na temat barkodów grzybów, a PR2 – na temat sekwencji rybosomowych dla królestwa Protista. Istnieją także bazy danych dotyczących wyłącznie ryb, roślin czy gatunków występujących na terenie określonego kraju.

Zastosowanie barkodingu DNA

Jednym z przykładów zastosowania barkodingu DNA jest analiza taksonomiczna motyla Astraptes fulgerator, występującego w Ameryce Północnej i Południowej. Na podstawie analizy morfologicznej jego larw oraz zjadanych przez nie roślin ustalono, że nie jest to jeden gatunek motyla, lecz kilka różnych. W 2004 r. pomysłodawca barkodingu Paul Hebert wraz z zespołem przeprowadzili identyfikację tego motyla z wykorzystaniem genu oksydazy cytochromu c. Według ustaleń badaczy w populacji tych motyli znajdowało się dziesięć różnych gatunków. Późniejsze analizy zmieniły liczbę gatunków do maksymalnie siedmiu.

RB2Zro0vSCKY4

Zdjęcie przedstawia motyla z gatunku Astraptes fulgerator. Ma on brązowe skrzydła, niebieska głowę i częściowo niebieski odwłok. Motyl siedzi na łodydze.

Ponadto barkoding DNA, ze względu na możliwość dokładnej identyfikacji organizmów, wykorzystywany jest m.in. w analizie żywności, monitorowaniu rozprzestrzeniania się gatunków inwazyjnych czy medycynie. Poszczególne zastosowania zostały przedstawione na poniższej mapie pojęć.