Wróć do informacji o e-podręczniku Wydrukuj Pobierz materiał do PDF Pobierz materiał do EPUB Pobierz materiał do MOBI Zaloguj się, aby dodać do ulubionych Zaloguj się, aby skopiować i edytować materiał Zaloguj się, aby udostępnić materiał Zaloguj się, aby dodać całą stronę do teczki

Modyfikacja genetyczna

Aby uzyskać organizmy o ulepszonych lub nowych cechach korzystnych dla rolnictwa, medycyny, biotechnologii czy innych dziedzin działalności człowieka, modyfikuje się ich geny. Modyfikacja genetyczna polega na wprowadzeniu do genomu biorcy takiego fragmentu DNA z innego organizmu, który odpowiada za daną cechę (np. szybki wzrost). Przeniesiony fragment genu (transgen) jest na stałe włączany do genomu gospodarza i przekazywany organizmom potomnym.

Proces modyfikacji genetycznej obejmuje kilka etapów: fragmentację DNA zawierającego żądaną informację genetyczną, powielanie odcinka DNA i włączenie obcego DNA do docelowego organizmu.

Fragmentacja DNA zawierającego żądaną informację genetyczną

Fragmentacja DNA odbywa się przy pomocy enzymów restrykcyjnychenzymy restrykcyjne, restryktazyenzymów restrykcyjnych, które przecinają nić kwasu deoksyrybonukleinowego w ściśle określonym miejscu. Właściwe odcinki DNA są następnie izolowane, w czym pomocna jest metoda elektroforezyelektroforezaelektroforezy, która pozwala na segregację fragmentów DNA o różnych długościach.

Powielanie odcinka DNA

Do namnażania (klonowania) fragmentów DNA wykorzystuje się dwie techniki laboratoryjne biologii molekularnej:  klonowanie DNA z udziałem bakterii lub komórek eukariotycznych oraz reakcję łańcuchową polimerazy (PCRPCRPCR, ang. Polymerase Chain Reaction).

1. Klonowanie DNA z udziałem bakterii lub komórek eukariotycznych

Technika ta polega na wprowadzeniu obcego DNA do komórek bakterii (transformacjitransformacjatransformacji) lub do komórek eukariotycznych (np. drożdży) (transfekcjitransfekcjatransfekcji). W tym celu wykorzystuje się wektorywektor genetycznywektory. Obecnie najczęściej stosowanymi wektorami są fagi, plazmidy i kosmidy, sztuczny chromosom bakteryjny (BAC), a także wektory drożdżowe oraz pochodne wirusów. Po tym, jak wektor zostanie wprowadzony do odpowiednich komórek, są one namnażane, a na koniec izoluje się z nich pożądane fragmenty DNA.

2. Reakcja łańcuchowa polimerazy

Namnażanie DNA przebiega w powtarzających się cyklach, które obejmują:

  • denaturację, czyli rozplatanie podwójnej helisy DNA w podwyższonej temperaturze;

  • annealing, czyli obniżenie temperatury, które pozwala na przyłączenie się starterów replikacji;

  • elongację, czyli dobudowanie komplementarnych fragmentów DNA przy pomocy polimerazy DNA.

Włączenie obcego DNA do docelowego organizmu

Włączenie obcego DNA do organizmu może się odbywać w różny sposób, zależny m.in. od rodzaju modyfikowanego organizmu. W przypadku bakterii DNA może być wprowadzony np. przy pomocy zmodyfikowanych plazmidów. Do modyfikacji komórek roślinnych można zastosować bakterie (Agrobacterium) zawierające zmodyfikowane plazmidy: bakterie przenoszą je do komórek roślinnych, wskutek czego obce DNA włącza się w chromosomchromosomchromosom roślinny, a następnie z komórek regenerowane są rośliny (oznacza to, że z jednej komórki powstaje cała roślina). Obce DNA wprowadza się do komórek roślinnych również bez pośrednictwa bakterii, np. „wstrzeliwując” je do komórek. Ponieważ komórki zwierzęce nie wykazują totipotencji (czyli zdolności do odtworzenia organizmu z dowolnej komórki), modyfikacji poddaje się głównie zygoty, komórki zarodka albo gamety, z których powstanie nowy organizm. Do komórek zwierzęcych obce DNA wprowadza się poprzez mikroiniekcję lub przy użyciu liposomów.

RAXrdnqsC1QKj1
Grafika przedstawia schemat reakcji PCR. Na początku przedstawiono fragment podwójnej nici DNA, która będzie ulegać replikacji, a także rozproszone wokół niej nukleotydy oraz startery DNA. Następnie fragment DNA ulega denaturacji i jego nici ulegają rozłączeniu. Denaturacja polega na rozpleceniu podwójnej helisy matrycowego DNA. Zachodzi w wysokiej temperaturze (zwykle ok. 95°C), w której dochodzi do pękania wiązań wodorowych, w konsekwencji czego helisa DNA rozdziela się na pojedyncze nici. Do każdej z pojedynczych nici przyłącza się następnie od końca 3' starter DNA, czyli zachodzi annealing. Annealing polega na przyłączaniu starterów, czyli hybrydyzacji – tworzeniu odcinków dwuniciowych złożonych ze starterów oraz matrycowej cząsteczki DNA. Etap ten przebiega w niższej temperaturze od denaturacji (40–60°C). Następnie zachodzi elongacja. Do nici matrycowych przyłączają się kolejne nukleotydy, tworząc nici komplementarne. Temperatura mieszaniny ustawiana jest w zakresie optimum działania enzymu, który został użyty w reakcji, np. 72 stopnie celsjusza dla polimerazy Taq. Polimeraza syntetyzuje komplementarną nić przy użyciu dostarczonych do mieszaniny trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP). Prawidłowa praca polimerazy jest możliwa wyłącznie w odpowiednich warunkach, które są zapewnianie przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej właściwego buforu. Powstałe w ten sposób podwójne nici DNA ponownie ulegają procesom denaturacji, annealingu i elongacji, w wyniku czego powstaje wiele takich samych cząsteczek DNA.
Schemat reakcji PCR.
Źródło: Enzoklop, Wikipedia Commons, licencja: CC BY-SA 3.0.

Obce DNA przed wprowadzeniem do nowego organizmu można poddawać modyfikacjom. Jest to szczególnie istotne, gdy wprowadza się geny organizmu eukariotycznego do komórki bakteryjnej. Ponieważ geny bakterii nie zawierają intronów, organizmy te nie mogą wycinać ich z mRNA. Dlatego zwykle wprowadza się do nich geny otrzymane poprzez syntezę DNA (tzw. cDNA) na podstawie mRNA z wyciętymi intronami (proces odwrotnej transkrypcji). Po procesie transformacji genetycznej zwykle konieczne jest jeszcze wyselekcjonowanie osobników o zmienionym genotypie.

Więcej na temat:

Słownik

bufor
bufor

roztwór o stałym stężeniu jonów wodorowych (pH), które pod wpływem dodatku niewielkich ilości kwasu lub zasady oraz przy rozcieńczaniu roztworu ulega nieznacznym zmianom

chromosom
chromosom

struktura zawierająca materiał genetyczny komórki

elektroforeza
elektroforeza

jedno ze zjawisk elektrokinetycznych polegające na poruszaniu się naładowanych cząstek (makrocząsteczek lub cząstek koloidowych w nieruchomym ośrodku rozpraszającym albo jonów w roztworze wewnątrz kapilary) pod wpływem pola elektrycznego

enzymy restrykcyjne, restryktazy
enzymy restrykcyjne, restryktazy

rozpoznają określone kilkunukleotydowe sekwencje łańcucha DNA obcego dla komórki (np. DNA wirusa, który przeniknął do bakterii) i wycinają je, rozkładając hydrolitycznie wiązanie fosfodiestrowe w tych odcinkach łańcucha; przecięcie może być tzw. tępe, gdy przechodzi przez te same miejsca obu nici DNA, lub tzw. lepkie, gdy cięcia w obu niciach są przesunięte względem siebie np. o kilka nukleotydów

PCR
PCR

łańcuchowa reakcja polimerazy; metoda powielania fragmentów DNA poprzez wielokrotne podgrzewanie i oziębianie próbki

transfekcja
transfekcja

wprowadzenie do komórek eukariotycznych obcego DNA przez wytworzenie porów w błonie komórkowej za pomocą prądu elektrycznego, bombardowania komórek kulkami ze złota lub wolframu opłaszczonymi DNA lub wprowadzeniu obcego DNA do komórki za pomocą cienkich kapilar

transformacja
transformacja

zmiana cech dziedzicznych danego szczepu bakterii pod wpływem pobranego z otoczenia DNA

dNTP
dNTP

trifosforany deoksynukleotydów (dNTP) to mieszanina nukleotydów, w której skład wchodzą: dATP, dGTP, dCTP oraz dTTP, odpowiadające kolejno adeninie, guaninie, cytozynie i tyminie

wektor genetyczny
wektor genetyczny

cząsteczki lub organizmy zdolne do przeniesienia informacji genetycznej do organizmu biorcy