Przeczytaj
Białko zielonej fluorescencji (GFP, ang. green fluorescence protein) zostało po raz pierwszy wyizolowane w 1962 roku przez japońskiego biochemika Osamu Shimomura z ciała meduzy Aequorea victoria. Naukowiec wraz ze współpracownikami zajmował się bioluminescencjąbioluminescencją, czyli zjawiskiem emisji światła przez żywe organizmy.
Początkowo odkryto białko o nazwie akworyna, które w obecności jonów wapnia emituje światło niebieskie. Jednak meduzy, z których zostało ono wyizolowane, świeciły światłem zielonym. Okazało się, że niebieskie światło emitowane przez wzbudzoną akworynę jest pochłaniane przez białko GFP. Absorpcja światła powoduje wzbudzenie białka GFP, które następnie emituje światło zielone.
W 2008 roku za odkrycie oraz zbadanie budowy i właściwości białka zielonej fluorescencji Osamu Shimomura otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Wspólnie z nim zostali uhonorowani jeszcze dwaj inni naukowcy – Roger Y. Tsien za opracowanie stabilniejszej formy białka GFP oraz Martin Chalfie za wprowadzenie genu kodującego białko GFP do komórek prokariotycznych (bakteria Escherichia coli) i eukariotycznych (nicień Caenorhabditis elegans).
Budowa i właściwości GFP
Elementem budowy białka GFP odpowiedzialnym za emisję światła jest chromoforchromofor. Układ ten powstaje z trójki kolejnych aminokwasów: seryny, tyrozyny i glicyny na drodze modyfikacji posttranslacyjnejmodyfikacji posttranslacyjnej białka GFP i jest indukowany przez łańcuchy boczne beta‑baryłki. Umożliwia to powstanie charakterystycznego dla chromoforów układu sprzężonych wiązań podwójnych.
Chromofor pochłania (absorbuje) światło o określonej długości fali i tym samym przechodzi ze stanu podstawowego w stan wzbudzony. Powrót do stanu podstawowego jest możliwy dzięki emisji światła o większej długości fali i tym samym niższej energii niż światło zaabsorbowane. Emisja światła zielonego przez białko GFP trwa tak długo, jak długo białko to jest pobudzane niebieskim światłem. Zjawisko to nazywa się fluorescencjąfluorescencją.
Zmiany w obrębie chromoforu mogą prowadzić do powstania białek emitujących światło o innej barwie. Do analogów białka GFP należą między innymi: białko BFP (ang. blue fluorescence protein) świecące na niebiesko, białko CFP (ang. cyan fluorescence protein) świecące na cyjanowo czy białko YFP (ang. yellow fluorescence protein) świecące na żółto.
Nie tylko meduzy są w stanie naturalnie świecić. Niektóre grzyby rosnące w lasach tropikalnych również mają takie zdolności. Dotychczas nie znaleziono przyczyny występowania tego zjawiska u grzybów. Fluorescencja występuje również u świetlików Photinus pyralis za sprawą obecności w ich organizmach enzymu lucyferazy, który katalizuje utlenianie lucyferyny i tym samym wywołuje bioluminescencję.
Zastosowanie GFP w modyfikacjach genetycznych organizmów
Nowoczesna biotechnologia, wykorzystująca metody i techniki inżynierii genetycznej, ingeruje w materiał genetyczny organizmu na poziomie molekularnym. Dzięki tym działaniom możliwe jest uzyskanie organizmu modyfikowanego genetycznie – GMOGMO (ang. genetically modified organism), na drodze: zmiany aktywności genu, wstawienia dodatkowej kopii genu lub wprowadzenia do genomu obcego genu pochodzącego od innego gatunku. Ostatnie działanie pozwala na otrzymanie organizmu transgenicznegoorganizmu transgenicznego, który oprócz własnych genów zawiera dodatkowo transgentransgen. Ekspresja transgenu przejawia się obecnością nowej cechy fenotypu. W przypadku komórek prokariotycznych wprowadzenie obcego fragmentu DNA nazywa się transformacjątransformacją, a w przypadku komórek eukariotycznych – transfekcjątransfekcją.
W 1987 roku Douglas Prasher, amerykański biotechnolog, zaproponował wykorzystanie białka zielonej fluorescencji jako cząsteczki śledzącej podczas modyfikacji genetycznych. Białko zielonej fluorescencji, a także inne białka fluorescencyjne, dzięki licznym zaletom są obecnie szeroko stosowane w modyfikacjach genetycznych organizmów. Połączenie genu kodującego białko GFP z genem kodującym inne białko prowadzi do powstania tzw. białka fuzyjnego, będącego hybrydą dwóch białek: białka GFP i białka poddawanego badaniom. Dzięki temu, po naświetlaniu światłem niebieskim lub UV, białko fuzyjne fluoryzuje na zielono. Daje to możliwość obrazowania w czasie rzeczywistym ekspresji genów, lokalizacji białek i ich przemieszczania się w komórce, a także budowy chromosomów i struktur komórkowych.
Zastosowanie białka GFP jako znacznika fluorescencyjnego do obrazowania związków chemicznych i struktur komórkowych jest możliwe ze względu na jego właściwości:
Odkrycie białka zielonej fluorescencji zrewolucjonizowało badania biologii komórki wykorzystującej mikroskopię fluorescencyjną. W przeciwieństwie do wcześniej stosowanych znaczników fluorescencyjnych białko GFP nie jest fototoksyczne. Właściwość ta pozwala prowadzić badania na żywych komórkach, co umożliwia bezpośrednią obserwację zachodzących w nich procesów.
GloFish®️ to seria opatentowanych, genetycznie modyfikowanych ryb (początkowo z gatunku Danio rerio) wprowadzonych na rynek przez amerykańską firmę Yorktown Technologies. Genetyczna modyfikacja tych ryb polega na wprowadzeniu do ich genomu genu kodującego białko GFP lub genów kodujących inne białka fluorescencyjnefluorescencyjne. Dzięki ekspresji tych genów ryby świecą na różne kolory. Co ciekawe, posiadanie takich ryb w Polsce jest zakazane.
Słownik
zdolność żywych organizmów do emisji światła
część cząsteczki zawierająca układ sprzężonych wiązań podwójnych, odpowiadająca za emisję światła
reakcja usunięcia cząsteczki wody ze związku chemicznego
emisja światła przez wcześniej wzbudzoną cząsteczkę lub atom, zanikająca po ustaniu czynnika wzbudzającego
organizm modyfikowany genetycznie; organizm, którego genom został zmieniony przy użyciu metod i technik inżynierii genetycznej w celu uzyskania nowych cech fenotypu
modyfikacja białka zachodząca po zakończeniu procesu translacji, wpływająca na jego budowę, strukturę, właściwości i funkcjonowanie
organizm o zmienionym genomie, który oprócz własnych genów zawiera obcy gen, pochodzący z innego organizmu
obcy gen przeniesiony z komórek jednego organizmu do innego przy użyciu metod i technik inżynierii genetycznej, nadający modyfikowanemu organizmowi nowe cechy
wprowadzenie obcego fragmentu DNA do komórki eukariotycznej
wprowadzenie obcego fragmentu DNA do komórki prokariotycznej