Cząsteczki, które mają ładunek, mogą się poruszać pod wpływem przepływającego prądu elektrycznego. Ruch cząsteczek ujemnie naładowanych w kierunku anody nazywany jest anaforeząanaforezaanaforezą, a cząsteczek naładowanych dodatnio w kierunku katody – kataforeząkataforezakataforezą.

Elektroforeza jest zjawiskiem polegającym na poruszaniu się naładowanych cząstek (makrocząsteczek lub cząstek koloidowych) w nieruchomym ośrodku rozpraszającym, pod wpływem pola elektrycznego. Odbywa się to w kierunku elektrod przeciwnego znaku. Omówmy to na przykładzie elektroforezy żelowej, PAGE (od ang. polyacrylamide gel electrophoresis).

Elektroforezę żelową przeprowadza się w specjalnych aparatach, na płytkach wyłożonych najczęściej żelem z polimerów, np. poliakrylamidem. Żel tworzy nieruchomy ośrodek, w którym znajduje się mieszanina poddana rozdzielaniu lub/i analizie.

R8VldBZkjfoHh

Na zdjęciu znajduje się plastikowy, przezroczysty zbiornik kształtem przypominający prostopadłościan. Na górze zbiornika po lewej stronie jest czerwony przewód, po prawej stronie czarny. Na obudowie u góry jest napis: XCell Sure Lock.

Płytkę o długości i szerokości kilku centymetrów pokrywa się cienką warstwą polimeru (pełniącego funkcję żelu). Na jednym z końców płytki znajdują się zagłębienia, zwane studzienkami, do których wprowadzane są analizowane substancje lub mieszaniny. Badane substancje są rozpuszczone w rozpuszczalniku o większej gęstości niż żel. Do jednej ze studzienek wprowadza się odpowiedni marker, czyli mieszaninę znanych związków o zdefiniowanej masie, służącej jako wzorzec. Wzdłuż przeciwległych krawędzi płytki znajdują się elektrody, przez które przepływa prąd.

Do elektrod przykłada się prąd stały lub pulsujący, o napięciu od 50 do 3000 V. W zależności od wartości przyłożonego napięcia, proces zachodzi szybciej lub wolniej. Aby uzyskać większą dokładność rozdzielania/identyfikacji, stosuje się niższe napięcie, co pozwala na lepsze rozdzielanie badanej mieszaniny, przy jednoczesnym wydłużeniu czasu, a nie procesu. Użycie wyższego napięcia powoduje przyspieszenie procesu, jednak może spowodować zniszczenie żelu. Po zakończonym procesie rozdzielania płytkę wybarwia się odpowiednimi barwnikami, aby odczytać wynik przeprowadzonego eksperymentu.

Rcf6dlhueUdv9

Rysunek przedstawia pionowy prostokąt. Na dole w narożnikach zaznaczono plus, u góry minus. U góry znajdują się trzy płytkie wgłębienia - od lewej czarne oznaczone jest literą M - to marker, drugie czerwone oznaczone rzymską cyfrą jeden - to mieszanina pierwsza, trzecie żółte oznaczone rzymską cyfrą dwa - to mieszanina druga.

Na przedstawionym powyżej rysunku płytki do elektroforezy, wgłębienia to studzienki, do których wprowadza się marker oraz badane mieszaniny związków, a po bokach widoczne są elektrody. Warto zwrócić uwagę na kierunek rozmieszczenia elektrod. Przy takim ich ułożeniu możemy oznaczać cząsteczki lub związki negatywnie naładowane. W przypadku cząstek naładowanych dodatnio, elektrody powinny być założone odwrotnie.

RW4tiI6qCfEN9

Rysunek przedstawia dwa pionowe prostokąty znajdujące się obok siebie. U góry prostokątów znajdują się trzy płytkie wgłębienia - od lewej czarne oznaczone jest literą M - to marker, drugie czerwone oznaczone rzymską cyfrą jeden - to mieszanina pierwsza, trzecie żółte oznaczone rzymską cyfrą dwa - to mieszanina druga. Pomiędzy dwoma prostokątami jest strzałka z napisem napięcie. W drugim prostokącie pod markerem znajduje się osiem krótkich, poziomych linii, pod mieszaniną pierwszą są trzy poziome linie – znajdują się na poziomie trzeciej, piątej i siódmej linii pod pierwszym wgłębieniem, pod mieszaniną drugą również są trzy poziome linie – znajdują się na poziomie drugiej, czwartej i ósmej linii pierwszego wgłębienia.

RqUM65fEU8DbW

Rysunek przedstawia pionowy prostokąt. U góry znajdują się trzy płytkie wgłębienia - od lewej czarne oznaczone jest literą M - to marker, drugie czerwone oznaczone rzymską cyfrą jeden - to mieszanina pierwsza, trzecie żółte oznaczone rzymską cyfrą dwa - to mieszanina druga. Po lewej stronie prostokąta znajduje się podziałka liniowa. Zaznaczono na niej wartości masy podanej w kilodaltonach. Są tam wartości od dziesięciu do miliona. W prostokącie pod markerem znajduje się osiem krótkich, poziomych linii. Linia położona najniżej jest przy wartości około 50 kilodaltonów. Linia położona najwyżej jest na wysokości około 200 000 kilodaltonów. Pod mieszaniną pierwszą są trzy poziome linie – znajdują się na poziomie trzeciej, piątej i siódmej linii pod pierwszym wgłębieniem, pod mieszaniną drugą również są trzy poziome linie – znajdują się na poziomie drugiej, czwartej i ósmej linii pierwszego wgłębienia. Po lewej stronie schematu obok prążków jest skala od 10 do 1 000 000 - to masa kilodaltonów.

Jak można zauważyć na powyższym rysunku, cząstki o wyższych masach znajdują się bliżej punktu startowego, a cząstki o mniejszych masach są dalej od punktu startowego. Wynika to stąd, że małe cząstki poruszają się szybciej w żelu. Wprowadzony do pierwszej studzienki marker, służący jako wzorzec, pozwala wyskalować wartości mas poszczególnych fragmentów. Mieszaniny I i II są mieszaninami trójskładnikowymi. Porównując pasy wzorca z pasami składników mieszanin, możemy oszacować ich masy.

Podsumowując, elektroforeza jest metodą analityczną, pozwalającą określać ilość związków w mieszaninie oraz oszacować ich masę. Służy ona chemikom, biochemikom, biologom czy genetykom do określania składu mieszanin poreakcyjnych czy ustalania sekwencji DNA oraz RNA.

Słownik

Bibliografia

Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L., Biochemia, Warszawa 2002, wyd 5.

Encyklopedia PWN

Helmenstine A. M., Electrophoresis Definition and Explanation, „ThoughtCo” 2018.