Przeczytaj
Identyfikacja organizmów
Identyfikacja organizmów i przypisywanie ich do odpowiednich taksonów to żmudny proces, wymagający dużego nakładu czasu oraz dokładności. W przeszłości jedną z technik stosowanych w badaniu pokrewieństwa była analiza fenotypowafenotypowa, skupiająca się na cechach fenotypowych organizmów. Stworzone tą metodą drzewa filogenetyczne pozwalały na wstępne ustalenie gatunku danego organizmu. Jednak zostały one istotnie zmienione na podstawie wyników badań DNA.
Analiza fenotypowa związana jest z dużym prawdopodobieństwem błędu, ze względu na możliwość niezależnego wykształcenia się cech u różnych organizmów czy plastyczność fenotypu. Dzięki rozwojowi technik analizy kwasów nukleinowych, w tym sekwencjonowaniasekwencjonowania, oraz wiedzy z zakresu budowy genomówgenomów, a także dzięki utworzeniu baz danych zawierających już poznane genomy możliwe stało się dokładne prześledzenie procesów ewolucji i ustalenie pokrewieństwa między gatunkami. W efekcie wiele organizmów zostało przeklasyfikowanych do innych taksonów.
Jedną z technik identyfikacji organizmu, które opierają się na analizie sekwencji kwasów nukleinowych, jest barkoding DNA.
Identyfikacja organizmu metodą barkodingu DNA
Ograniczenia w identyfikacji organizmów na podstawie ich morfologii spowodowały, że konieczne było opracowanie nowego systemu klasyfikacji, który obarczony jest niskim poziomem błędu, a także jest łatwy w wykorzystaniu oraz – co ważne – uniwersalny. Dzięki uniwersalności laboratoria na całym świecie mogą korzystać z tych samych rozwiązań, co pozwala na szybką wymianę danych i zapewnia wiarygodność ustaleń. Metodą, która spełnia wszystkie te wymagania, jest barkoding DNA. Opiera się ona na identyfikacji krótkich sekwencji DNA, zwanych barkodamibarkodami. Ich analiza umożliwia szybką i wiarygodną identyfikację gatunków znanych, a także ustalenie klasyfikacji gatunków nowo odkrytych. Metoda ta pozwala rozróżnić gatunki bez względu na stadium rozwojowe.
System identyfikacji organizmów na podstawie barkodów został opracowany w 2003 r. przez Paula Heberta, kanadyjskiego naukowca. Technika ta jest podobna do identyfikacji towarów w sklepie na podstawie kodów kreskowych – barkody stanowią swoiste kody kreskowe DNA, a analiza ich sekwencji pozwala na rozpoznanie gatunku.
Barkody
Barkod, czyli sekwencja DNA wykorzystywana do identyfikacji organizmów, musi posiadać określone cechy:
wykazywać się niską zmiennością w obrębie gatunków, równocześnie charakteryzując się wysoką zmiennością na poziomie międzygatunkowym;
być krótkim odcinkiem DNA – sekwencja powinna zawierać ok. 600 par zasad;
być otoczonym przez regiony o wysokim stopniu konserwacjikonserwacji;
występować w wielu kopiach;
występować w regionie, który nie może być miejscem częstych zmian w sekwencji DNA.
Ze względów technicznych bardzo ważne są cechy barkodu związane z jego długością, umiejscowieniem w genomie, a także liczbą kopii. Krótka sekwencja barkodu przyspiesza proces sekwencjonowania próbki. Jest to istotne zwłaszcza w przypadku prób środowiskowych, w których występuje wiele różnych gatunków. Z kolei niezmienność danego regionu w genomie pozwala na zaprojektowanie uniwersalnych dla gatunku starterówstarterów, umożliwiających powielenie DNA. Natomiast duża liczba kopii barkodu wpływa na dokładniejszą identyfikację organizmów z próbek zdegradowanych, pochodzących z materiałów kopalnych czy niewielkich fragmentów tkanek.
Przykłady stosowanych barkodów
Ze względu na ogromną różnorodność organizmów żywych nie jest możliwe wykorzystanie jednego, uniwersalnego barkodu. Inne sekwencje są stosowane do identyfikacji zwierząt, a inne w przypadku roślin czy grzybów.
Sekwencje barkodów rzadko pochodzą z genomu jądrowego – częściej stosowane są te zlokalizowane w genomie mitochondrialnym. W porównaniu z DNA mitochondrialnymDNA mitochondrialnym, materiał genetyczny zawarty w jądrze komórkowym w większym stopniu podlega mechanizmom ochrony oraz naprawy DNA, przez co rzadziej dochodzi w nim do zmian. Barkody z DNA jądrowegoDNA jądrowego miałyby także małą liczbę kopii, co mogłoby utrudnić identyfikację. Ponadto do zalet genomu mitochondrialnego należą jego sposób dziedziczenia (dziedziczenie uniparentalne – DNA mitochondrialny zwykle dziedziczony jest wyłącznie po matce) oraz brak sekwencji intronowych (sekwencji niekodujących, które nie skutkują powstaniem na ich bazie łańcucha aminokwasowego).
Barkody wykorzystywane u zwierząt
Przykładem wykorzystania sekwencji mitochondrialnych jako barkodów jest fragment genu CO1, odpowiedzialnego za kodowanie enzymu oksydaza cytochromu c. Sekwencja długości 648 par zasad została wstępnie porównana między różnymi organizmami – do analizowanej grupy należało 2238 różnych gatunków zwierząt. Między niektórymi z nich wykazano zaledwie 2% różnice. Nieco większe różnice uzyskano w obrębie parzydełkowców.
Analizę na podstawie barkodu oksydazy cytochromu c wykonano także dla grupy naczelnych. Różnica między ludźmi wyniosła od 1 do 2 par zasad. Natomiast między ludźmi i szympansami wykazano różnicę ok. 60 par zasad, a między ludźmi i gorylami – 70 par zasad. Wyniki te wskazują, że wśród naczelnych najbliżej spokrewnione z ludźmi są szympansy.
Barkody wykorzystywane u roślin
W przypadku roślin identyfikacja gatunków na podstawie fragmentów mitochondrialnego DNA nie jest możliwa. Wynika to z jego małej zmienności, związanej z wolnym tempem mutacjimutacji. Lepsze rezultaty uzyskiwane są z wykorzystaniem chloroplastowego DNA. Jako sekwencje barkodowe stosowane są fragmenty genów enzymu maturaza K, odpowiedzialnego za splicingsplicing intronów, oraz gen rbcl (karboksylaza/oksygenaza rybulozo‑1,5‑bisfosforanu), związany z fazą ciemną fotosyntezy.
Barkody wykorzystywane u bakterii
W celu identyfikacji bakterii wykorzystywana jest mała podjednostka rybosomalna 16S, która wykazuje wysoki poziom konserwacji ewolucyjnej. Inne markery dające obiecujące wyniki to m.in. gen rpoB, kodujący podjednostkę beta polimerazy RNA, czy cpn60, związany z fałdowaniem białek.
Barkody wykorzystywane u grzybów
Identyfikację grzybów przeprowadza się na podstawie genu oksydazy cytochromu c, jednak analiza ta nie daje dobrych wyników dla wszystkich grup. Istnieje zatem konieczność wykorzystania dodatkowych barkodów. Jednym z markerów jest rRNA związany z dużą podjednostką rybosomalną (28S).
Biblioteki barkodów
Identyfikacja organizmów często wymaga wykorzystania więcej niż jednego barkodu. Pomocnym narzędziem w analizie wyników barkodingu DNA są biblioteki barkodów – bazy danych z sekwencjami sprawdzonych barkodów. Pozwala to na szybkie porównanie uzyskanych sekwencji z tymi, które zostały zgromadzone w bazie, co umożliwia sprawną identyfikację gatunków. Gdy danej sekwencji brakuje w bibliotece, tworzony jest nowy wpis dla danego gatunku.
Jedną z największych baz danych gromadzących sekwencje barkodowe jest BoLD (ang. Barcode of Life Data System). Od momentu powstania tej biblioteki w 2007 r. zgromadzono w niej ponad 6 mln sekwencji. Są to głównie barkody uzyskane w wyniku analiz sekwencji fragmentu genu CO1 u zwierząt. Inna biblioteka, UNITE, zawiera dane na temat barkodów grzybów, a PR2 – na temat sekwencji rybosomowych dla królestwa Protista. Istnieją także bazy danych dotyczących wyłącznie ryb, roślin czy gatunków występujących na terenie określonego kraju.
Zastosowanie barkodingu DNA
Jednym z przykładów zastosowania barkodingu DNA jest analiza taksonomiczna motyla Astraptes fulgerator, występującego w Ameryce Północnej i Południowej. Na podstawie analizy morfologicznej jego larw oraz zjadanych przez nie roślin ustalono, że nie jest to jeden gatunek motyla, lecz kilka różnych. W 2004 r. pomysłodawca barkodingu Paul Hebert wraz z zespołem przeprowadzili identyfikację tego motyla z wykorzystaniem genu oksydazy cytochromu c. Według ustaleń badaczy w populacji tych motyli znajdowało się dziesięć różnych gatunków. Późniejsze analizy zmieniły liczbę gatunków do maksymalnie siedmiu.
Ponadto barkoding DNA, ze względu na możliwość dokładnej identyfikacji organizmów, wykorzystywany jest m.in. w analizie żywności, monitorowaniu rozprzestrzeniania się gatunków inwazyjnych czy medycynie. Poszczególne zastosowania zostały przedstawione na poniższej mapie pojęć.
Słownik
sekwencja DNA umożliwiająca identyfikację organizmu; „kod kreskowy DNA”
zespół anatomicznych, fizjologicznych i biochemicznych cech organizmu, warunkowany zarówno genotypem, jak i oddziaływaniem środowiska, które można obserwować i mierzyć
kompletny zestaw informacji genetycznej organizmu
(ang. nuclear DNA) materiał genetyczny w postaci DNA znajdujący się w jądrze komórkowym eukariontów i kodujący większość informacji genetycznej organizmu
(ang. mitochondrial DNA) kwas deoksyrybonukleinowy występujący w mitochondriach; cząsteczki mtDNA są zazwyczaj koliste i zawierają od kilkunastu tysięcy (u zwierząt) do kilkunastu milionów (u roślin) par zasad; występują w liczbie od kilku (u zwierząt) do kilkudziesięciu (u roślin) kopii na organellę
nagła i trwała zmiana w liczbie i strukturze elementów dziedzicznych, zachodząca w żywym organizmie
ustalanie kolejności (sekwencji pierwszorzędowej) aminokwasów w polipeptydach oraz nukleotydów w łańcuchach kwasów nukleinowych
sekwencje aminokwasowe lub nukleotydowe w DNA lub RNA, które podczas ewolucji nie zmieniają się wcale lub zmieniają się w niewielkim stopniu i są podobne lub identyczne u wielu gatunków oddalonych od siebie pod względem ewolucyjnym
proces obróbki pierwotnego produktu transkrypcji prekursorowego RNA (preRNA); polega na wycinaniu odcinków RNA niekodujących białka (intronów) i łączeniu we właściwej kolejności odcinków kodujących (egzonów); w procesie tym nieciągła informacja genetyczna zawarta w DNA zostaje przekształcona w ciągłą
krótki, jednoniciowy oligonukleotyd, komplementarny do jednej z nici DNA, w procesie replikacji DNA dostarczający wolnej grupy 3′-OH, od której zależna od DNA polimeraza DNA może rozpocząć syntezę nowej nici