KlonklonKlon to identyczne genetycznie potomstwo jednej komórki lub jednego osobnika powstałe w wyniku podziału komórki lub organizmu. Wbrew powszechnemu przekonaniu klony mogą powstawać również drogą naturalną, niewymagającą zastosowania zaawansowanych technik laboratoryjnych. Wegetatywne rozmnażanie się u roślin i bezpłciowe u niektórych zwierząt to nic innego jak naturalne klonowanie, będące sposobem na zwiększenie liczby osobników. Podobnie jest w populacjach komórek bakteryjnych.

Próby sztucznego klonowania organizmów rozmnażających się wegetatywnie lub bezpłcioworozmnażanie bezpłciowebezpłciowo rozpoczęto już dawno. Dzisiaj sztuczne klony bakterii i roślin służą nauce i wykorzystywane są w uprawach, np. do szybkiego otrzymywania wartościowych odmian. Nieco więcej trudności nastręcza klonowanie zwierząt, gdyż rozmnażanie bezpłciowe występuje u nich rzadko. Jednak i w tym przypadku udało się pokonać bariery techniczne: powszechnie stosuje się klonowanie zwierząt przez bisekcję zarodków i przez transfer jądra komórkowego. Pozostałe metody, jak mechaniczne rozdzielanie blastomerówblastomeryblastomerów, nie znalazły zastosowania na szeroką skalę. W celach badawczych prowadzi się klonowanie chimerowe. Zastosowanie tej metody ograniczone jest do badań laboratoryjnych rozwoju komórek na etapie prenatalnym.

Techniką klonowania stosowaną na szeroką skalę jest bisekcja zarodków. Metoda ta polega na fizycznym rozdzieleniu tworzącego się zarodka na dwie części. Dokonuje się tego na etapie blastocystyblastocystablastocysty lub morulimorulamoruli. W tych stadiach blastomery zacieśniają się i wytwarzają połączenia. Dzięki temu podczas bisekcji zarodka nie dochodzi do dekompozycji i w konsekwencji rozpadu zarodka na wiele części. Dane eksperymentalne wskazują, że wyższy współczynnik udanych klonowań obserwuje się przy rozdziale zarodka na etapie blastocysty niż moruli.

Do tego typu klonowania wykorzystywane są specjalnie wyselekcjonowane zarodki. Pierwszym z kryteriów jest ich morfologia. Zarodki ocenia się pod kątem budowy i kształtu, wyszukując wszelkie widoczne nieprawidłowości w rozwoju. Drugim czynnikiem, który wpływa na efektywność klonowania, jest wielkość zarodka. Badania dowiodły, że lepsze wyniki uzyskiwano w przypadku implantacji dwóch zarodków niż jednego, co może być spowodowane niewystarczającym wczesnym sygnałem ciążowymsygnał ciążowysygnałem ciążowym.

Bisekcja zarodków jest relatywnie prostą metodą, której efektywność sięga zazwyczaj od 25% do 30%, a w przypadku niektórych eksperymentów – około 50%. Technika ta jest jednak inwazyjna, gdyż podczas podziału zarodka dochodzi do zniszczenia komórek. Jest to szczególnie dotkliwe w przypadku uszkodzeń komórek węzła zarodkowegowęzeł zarodkowywęzła zarodkowego, które znacznie zmniejszają efektywność klonowania. Badania w zakresie biologii molekularnej wskazują z kolei na zaburzenia w poziomie transkrypcji genów w zarodkach po podziale. W związku z problemami w postaci strat i uszkodzeń komórek w trakcie bisekcji metoda ta jest stale udoskonalana. Jednym ze sposobów (stosowanym u bydła) jest równoczesny rozwój blastocysty wewnątrz i na zewnątrz osłonki przejrzystej. Obie części blastocysty są wówczas połączone jedynie mostkiem komórkowym, który ułatwia przecięcie i ogranicza uszkodzenia komórek podczas bisekcji.

Metodą zbliżoną do bisekcji zarodków jest izolacja blastomerów. W technice tej wykorzystuje się jednak zarodki na wcześniejszych stadiach rozwoju: dwu-, cztero- oraz ośmiokomórkowym. Na tych etapach komórki charakteryzują się totipotencjątotipotencjatotipotencją, czyli zdolnością do różnicowania we wszystkie typy komórek. W technice tej blastomery hoduje się w pożywce pozbawionej jonów wapnia i magnezu. Prowadzi to do osłabienia połączeń międzykomórkowych i rozdzielenia komórek. Tak wyizolowane blastomery hoduje się do stadium moruli lub blastocysty, a następnie wszczepia do macicy biorcy.

Izolacja blastomerów to metoda, która pozwala na tworzenie większej liczby klonów niż w przypadku bisekcji zarodków. Dzięki tej technice udało się uzyskać nawet pięcioraczki. Jej wadą jest niska wydajność, dlatego nie znalazła ona zastosowania na szeroką skalę w tworzeniu klonów zwierząt. Metodę tę wykorzystuje się jednak do celów naukowych w sytuacji, gdy nie można użyć całego zarodka. Badania eksperymentalne wykazują, że zastosowanie tej techniki jest najczęściej możliwe w przypadku zarodków składających się z 4 blastomerów (czasami 2 lub 8). Wynika to z utraty totipotencjalnego charakteru komórek rozwijającego się zarodka. Problem z potencjałem do różnicowania się komórek ogranicza wykorzystanie tej metody w „fabryce zwierząt”, czyli klonowaniu zwierząt na skalę przemysłową.

Rozdzielenie dwóch blastomerów stosuje się z powodzeniem w klonowaniu myszy, owiec, świń i bydła. W przypadku myszy rozdział na etapie dwóch blastomerów daje najlepsze efekty. Klonowanie świń tą metodą jest jednak mniej skuteczne niż w przypadku transferu jąder komórkowych. Rozdzielanie blastomerów w zarodkach ośmiokomórkowych daje dobre efekty u kóz, owiec i bydła, jednak wydajność jest mniejsza niż w przypadku bisekcji zarodków, która została z sukcesem zastosowana nawet u ssaków naczelnych. Owce i bydło to organizmy, na których najczęściej przeprowadza się ten sposób klonowania.

Technika klonowania, która nie znalazła zastosowania przemysłowego, lecz jest wykorzystywana w badaniach nad przebiegiem rozwoju prenatalnego, to klonowanie chimerowe oparte na agregacji blastomerów. Metoda ta wykorzystuje wyizolowane blastomery danego organizmu, które otacza się tzw. blastomerami nośnikowymi, uzyskanymi z organizmu należącego do innego gatunku. W ten sposób powstaje zarodek zbudowany z komórek pochodzących od różnych gatunków. Blastomery nośnikowe mają być odpowiedzialne za wytworzenie trofoblastutrofoblasttrofoblastu, który odpowiada za implantację w ścianie macicy. Z blastomerów wewnętrznych wykształca się z kolei przyszły osobnik. W przypadku takiego klonowania może jednak powstać osobnik allogeniczny, który będzie zawierał geny nie tylko organizmu macierzystego.

Do wad tego sposobu klonowania należą skomplikowana metodologia, konieczność analizy potencjału do różnicowania komórek oraz niska efektywność. Ponadto w wyniku izolacji blastomerów często dochodzi do ich uszkodzenia. W związku z tym technika ta wykorzystywana jest głównie w badaniach naukowych i nie stosuje się jej do klonowania zwierząt na szerszą skalę.

Wszystkie wymienione do tej pory metody związane są z zarodkami. Powstające w ich rezultacie zwierzęta stanowią genetyczne kopie nienarodzonego osobnika, z którego komórek zarodkowych powstały. Wyzwaniem stało się wykorzystanie komórek somatycznych dorosłego ssaka do stworzenia klonu. Podjęli się tego biolodzy z całego świata, a jako pierwsi pomyślne wyniki swojego eksperymentu ogłosili naukowcy ze szkockiego Instytutu Roślin koło Edynburga, pracujący pod kierownictwem doktora Iana Wilmuta. W 1997 r. na łamach czasopisma „Nature” ukazał się artykuł opisujący sposób, w jaki udało się uzyskać pierwszego ssaka sklonowanego z komórki somatycznej dorosłego zwierzęcia.

Transfer jąder komórek somatycznych to obecnie jedna z najczęściej wykorzystywanych technik klonowania. Początki były jednak bardzo trudne z powodu niewielkiej wydajności procesu oraz ogromnego nakładu pracy. W przypadku owcy Dolly z 277 zygot przeżyło jedynie 29 zarodków, z których dorosłość osiągnęła jedna owca. Wydajność tej metody osiągnęła zaledwie 0,3%. Nie lepiej wyglądały statystyki w przypadku sklonowanego byka Chance, którego klon Second Chance przyszedł na świat w 1999 roku. W tym eksperymencie dokonano transferu 189 jąder komórek somatycznych do komórek jajowych, w wyniku czego uzyskano tylko jednego osobnika. Warto wspomnieć, iż dawca komórek somatycznych (byk Chance) był organizmem bardzo sędziwym. Dożył 21 lat, a komórki, których użyto w procesie klonowania, pobrano krótko przed jego śmiercią.

Obecnie klonowanie jest bardziej wydajne i mniej pracochłonne dzięki automatyzacji wielu etapów. Klonowanie zwierząt hodowlanych tą metodą jest możliwe dzięki stosunkowo wysokiej skuteczności, która jednak waha się u różnych gatunków zwierząt: od 1% u myszy do 20% u bydła. Pojawiły się również doniesienia z Chin, według których klonowanie świń tą metodą charakteryzowało się skutecznością na poziomie od 70% do 80%. Może to wskazywać na rozwój prawdziwej fabryki zwierząt w tym kraju. Automatyzacja procesu transferu jądra komórkowego sprawia, że można uzyskać nawet kilkaset zarodków dziennie w jednym ośrodku, co przy kilkunastoprocentowej skuteczności może dać początek nawet 100 organizmom.

Metoda transferu jądra komórkowego ma pewne ograniczenie związane z reprogramowaniem epigenetycznymreprogramowanie epigenetycznereprogramowaniem epigenetycznym – procesem modyfikacji aktywności genów w komórce, które pozwalają na wejście komórek somatycznych w stan podziałów. Reprogramowanie epigenetyczne jest zjawiskiem słabo poznanym, a naukowcy nie potrafią go kontrolować. Proces ten wiąże się z dużym odsetkiem umieralności klonów ssaków na poziomie zarodka, a także chorób u narodzonych sklonowanych zwierząt. Błędy w reprogramowaniu epigenetycznym mogły być przyczyną otyłości i zwyrodnienia stawów, na które cierpiała owca Dolly. To właśnie możliwość zwiększonego prawdopodobieństwa wystąpienia chorób u sklonowanych ssaków jest jednym z argumentów przeciw reprodukcyjnemu klonowaniu człowieka.

Sukces twórców owcy Dolly odbił się szerokim echem w świecie naukowym. Pojawiły się twierdzenia, że sklonowanie dorosłego człowieka jest tylko kwestią czasu. Przemawiał za nimi przypadek udanego zastosowania metody transferu jądra komórkowego do sklonowania ssaków naczelnych – makaków krabożernych. Perspektywa ta wywołała lawinę głosów sprzeciwu. Więcej na ten temat przeczytasz w materiale: Obawy etyczne wokół klonowania zwierzątDurcC1d2nObawy etyczne wokół klonowania zwierząt.

Więcej informacji na temat klonowania zwierząt znajdziesz w materiale Klonowanie zwierząt oraz Praktyczne wykorzystanie metod klonowania organizmów.

Słownik