Sekwencjonowanie DNA jest jedną z podstawowych metod genetyki molekularnej, polegającą na odczytywaniu kolejności nukleotydów w nici DNA. Pierwszym osiągnięciem w tej dziedzinie było poznanie sekwencji „lepkiego końcalepkie końce DNAlepkiego końca” DNA bakteriofaga λlambda przez Raya Wu w 1968 r. Naukowiec ten został nazwany „ojcem sekwencjonowania DNA”. W 1977 r. zostały wprowadzone dwie metody sekwencjonowania DNA:

RX7CHefDgAr931

Zdjęcie przedstawia Fredericka Sangera. Mężczyzna ma krótkie włosy, neutralny wyraz twarzy, okulary z grubą oprawką.

• Metoda chemiczna - opracowana przez Allana Maxama i Waltera Gilberta, nazywana metodą chemicznej degradacji łańcucha DNA (inaczej metodą chemicznego zakończenia łańcucha DNA). Metoda ta polegała na wykorzystaniu radioaktywnego znacznika (izotopu fosforu), który przyłączał się na końcu 5′ łańcucha DNA. Następnie prowadzone były reakcje mające na celu modyfikację zasad azotowych nukleotydów, zależnie od wybranych substancji. Modyfikacje te prowadziły do ich oderwania od reszt cukrowych nukleotydu. Efektem było pęknięcie nici DNA za zmodyfikowanym nukleotydem. Mieszaniny reakcyjnie rozdzielano następnie za pomocą elektroforezy.

• Metoda enzymatyczna – bardziej popularna i stosowana do dzisiaj (z modyfikacjami), to metoda terminacji łańcucha opracowana przez Fredericka Sangera.

Skład czterech probówek do reakcji sekwencjonowania wygląda następująco:

1. probówka „A”: 4 nukleotydynukleotydynukleotydy → A, C, T, G, ddATP, polimerazapolimeraza DNApolimeraza DNA;

2. probówka „G”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddGTP, polimeraza DNA;

3. probówka „C”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddCTP, polimeraza DNA;

4. probówka „T”: 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddTTP, polimeraza DNA.

Efektem reakcji jest powstanie dużej liczby fragmentów DNA o różnej długości (C), uzależnionej od tego, który nukleotyd został dołączony do nici DNA na jej końcu.

W ostatnim kroku sekwencjonowania przeprowadzana jest elektroforezaelektroforezaelektroforeza, która ma na celu pokazanie nukleotydów terminalnych, czyli znajdujących się na końcu każdej z nici DNA. Po naświetleniu żelu, na którym są rozdzielone nukleotydy każdej z czterech probówek, można uzyskać obraz wyłącznie nukleotydów dołączonych na nowo i pokazać je na chromatogramie (D).

Opracowanie chemicznej oraz enzymatycznej metody sekwencjonowania DNA nie zakończyło procesu rozwoju technik sekwencjonowania. Obecnie techniki te są zautomatyzowane i przeprowadzane bez udziału niebezpiecznych związków radioaktywnych. Jedną z nowych metod sekwencjonowania jest tzw. pirosekwencjonowanie.

Pirosekwencjonowanie polega na odczytywaniu sekwencji DNA za pomocą elementów światłoczułych. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu odpowiednich enzymów, a także substratów reakcji. Matrycę w tej technice stanowi jednoniciowe DNA, do którego przyłączany jest wyznakowany starter. Matrycę inkubuje się następnie z:

• polimerazą DNA – najczęściej wolno syntetyzującą polimerazą z E. coli;

• sulfurylazą ATP – enzymem pozwalającym na syntezę ATP;

• lucyferazą – enzymem katalizującym przemianę lucyferyny w oksolucyferynę;

• apyrazą – enzymem degradującym wolne nukleotydy;

• adenozyno‑5’ fosfosiarczanem (APS) – substratem do syntezy ATP przez sulfurylazę ATP.

Do mieszaniny dodawany jest pierwszy rodzaj nukleotydów. W wyniku syntezy nici komplementarnej dochodzi do uwolnienia pirofosforanu, w ilości zależnej od ilości przyłączonych nukleotydów. Sulfurylaza ATP prowadzi syntezę ATP z uwolnionego pirofosforanu oraz dostarczonego do mieszaniny reakcyjnej APS. Powstały w ten sposób ATP stanowi źródło energii dla przemiany lucyferyny w oksolucyferynę, katalizowanej przez enzym lucyferazę. Reakcji tej towarzyszy emisja światła, które może być odczytane przez detektor. Wielkość odczytywanych pików jest zależna od ilości przyłączonych nukleotydów, w trakcie syntezy nici. Niewykorzystane nukleotydy są następnie degradowane przez apyrazę. Dopiero po zakończonym procesie degradacji możliwe jest dodanie kolejnego nukleotydu do mieszaniny.

Początkowo sekwencjonowano tylko niewielkie genomygenomgenomy, w tym wirusowe i bakteryjne. W 1994 r. poznano genom wirusa Epsteina‑Barr, a pierwszy genom bakteryjny zsekwencjonowano w 1995 r. i był to genom Haemophilus influenzae. Poznanie sekwencji genomów wirusowych i bakteryjnych pozwala m.in. na wykazanie ich mechanizmów działania, a także próbę ochrony przed patogennymi mikroorganizmami.

Pierwszym organizmem eukariotycznym, którego sekwencję poznano, były drożdże Saccharomyces cerevisiae (w 1996 r.). Dwa lata później zsekwencjonowano genom organizmu wielokomórkowego – nicienia Caenorhabditis elegans. Sekwencjonowanie genomów różnych organizmów w znaczący sposób przyczyniło się do poznania genomu człowieka. Sekwencje te stanowiły matrycę do analizy danych uzyskanych podczas sekwencjonowania genomu człowieka. Przyspieszyło to proces składania otrzymanych sekwencji w całość.

RKwQZ9MxlunNB1

Zdjęcie przedstawia laboratorium. Po lewej stronie widoczne jest dygestorium, po prawej regał z ponumerowanymi książkami.

Mitochondrialny genom człowieka zsekwencjonowano już w 1981 r., co przyczyniło się do podjęcia próby poznania sekwencji całego genomu człowieka. Wyniki Projektu poznania ludzkiego genomu (ang. Human Genome Project), trwającego od 1990 do 2003 r., opublikowano w 2001 r. Poznanie sekwencji genomu nie stanowiło jednak zakończenia całego procesu. Następnym zadaniem było udzielenie odpowiedzi na pytanie o rolę danych sekwencji, a także ich wpływ na funkcjonowanie genomu. Badania te prowadzone są nadal.

Sekwencjonowanie DNA jest często wykorzystywane w medycynie, a także biotechnologii i biologii molekularnej. Poznanie sekwencji DNA wybranego organizmu i zawartych w tym fragmencie informacji pozwala na ulepszenie i przyspieszenie diagnostyki chorób, a także bardziej spersonalizowaną terapię. Sekwencjonowanie DNA w medycynie znajduje zastosowanie także przy identyfikacji podłoża chorób nowotworowych.

Sekwencjonowanie jest pomocne także w identyfikacji chorób dziedzicznych, takich jak: mukowiscydoza, fenyloketonuria, choroba Huntingtona. Technika ta znalazła również zastosowanie w nieinwazyjnym badaniu płodu w kierunku potwierdzenia lub wykluczenia występowania u dziecka chorób genetycznych, takich jak zespół Downa czy zespół Edwardsa. W badaniach mikrobiologicznych sekwencjonowanie DNA jest wykorzystywane m.in. do identyfikacji bakterii, których rozpoznanie w warunkach laboratoryjnych jest trudne lub niemożliwe. Dzięki ustaleniu sekwencji DNA możliwe jest również poznanie genów kodujących czynniki wirulencji bakterii. Proces sekwencjonowania wykorzystywany jest także w analizie wektorów do modyfikacji genetycznych organizmów.

Słownik