Laboratorium 1

Przeprowadzono doświadczenie w pracowni genetycznej.

Prawidłowa sekwencja początkowego fragmentu genu łańcucha beta hemoglobiny: GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAG.

Temat: Sekwencjonowanie genu łańcucha beta hemoglobiny metodą Sangera

Problem badawczy: Czy sekwencja genu łańcucha beta hemoglobiny w pobranej próbce DNA jest prawidłowa?

Hipoteza 1: Sekwencja genu łańcucha beta hemoglobiny w badanej próbce jest prawidłowa.

Hipoteza 2: Sekwencja genu łańcucha beta hemoglobiny w badanej próbce nie jest prawidłowa.

Sprzęt laboratoryjny: cztery puste probówki Eppendorfa na statywie; pipeta automatyczna o objętości od 10 do 100 μmul; żel agarozowy.

Odczynniki: próbka z matrycowym DNA; mieszanina dideoksynukleotydów; ddATP znakowany żółtym barwnikiem; ddCTP znakowany niebieskim barwnikiem; ddGTP znakowany czerwonym barwnikiem; ddTTP znakowany zielonym barwnikiem; polimeraza DNA.

Instrukcja:

1. Przygotowano mieszaninę reakcyjną do reakcji łańcuchowej polimerazy PCR. Do czterech probówek Eppendorfa dodano za pomocą pipety automatycznej:

- 5 mikrolitrów matrycy DNA - z radioaktywnie wyznakowanym starterem;

- 10 mikrolitrów mieszaniny deoksynukleotydów;

- 3 mikrolitry dideoksynukleotydów (do każdej z probówek Eppendorfa inny rodzaj: ddATP, ddCTP, ddGTP, DDTTP).

2. Włożono cztery probówki Eppendorfa zawierające mieszaniny reakcyjne do termocyklera i przeprowadzono PCR.

3. Po zakończeniu PCR pobrano pipetą automatyczną po 10 mikrolitrów próbek Eppendorfa. Umieszczono je w studzienkach w żelu agarozowym. Przeprowadzono elektroforezę DNA.

4. Odczytano sekwencję DNA bezpośrednio z żelu. Wykonano ćwiczenia interaktywne.  

Szczegóły zjawiska 1

Przyłączenie dideoksynukleotydu uniemożliwia dalsze wydłużanie nici DNA przez polimerazę, ponieważ jest on pozbawiony grupy –OH w pozycji 3′, więc nie ma możliwości utworzenia wiązania fosfodiestrowego z kolejnym nukleotydem.

Szczegóły zjawiska 2

Do sekwencjonowania stosuje się wysoko rozdzielczą elektroforezę żelową, która umożliwia rozróżnienie nawet tych łańcuchów DNA, które różnią się tylko jednym nukleotydem.

Szczegóły zjawiska 3

Stężenie deoksynukleotydu musi być znacznie wyższe niż stężenie odpowiedniego dideoksynukleotydu, aby umożliwić wytworzenie wystarczającej liczby fragmentów przy jednoczesnej transkrypcji całej sekwencji.

Wyniki: DNA pochodzący z badanej próbki ma sekwencję: GTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG.

Wnioski: Fragment DNA zawiera mutację punktową w szóstym kodonie genu podjednostki beta hemoglobiny.

Weryfikacja hipotezy: Hipoteza 1 jest fałszywa. Hipoteza 2 jest prawdziwa.