W odpowiedzi wskaż metody stosowane w sekwencjonowaniu Sangera i sekwencjonowaniu Maxama i Gilberta

Sekwencjonowanie Sangera – metoda terminacji łańcucha z użyciem zmodyfikowanych nukleotydów, które blokują dalszą syntezę nici DNA.

Sekwencjonowanie Maxama i Gilberta – metoda chemicznej degradacji łańcucha lub metoda chemicznego zakończenia łańcucha DNA z wykorzystaniem substancji modyfikujących zasady azotowe nukleotydów poprzez spowodowanie pęknięcia nici DNA za zmodyfikowanym nukleotydem.

W zadaniu przedstaw skład probówek używanych do sekwencjonowania. Uwzględnij oznaczenia nukleotydów, nukleotydy terminalne oraz stosowany w sekwencjonowaniu enzym.

Probówka 1 – 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddATP, polimeraza DNA;
Probówka 2 – 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddGTP, polimeraza DNA;
Probówka 3 – 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddCTP, polimeraza DNA;
Probówka 4 – 4 nukleotydy → A, C, T, G, ddTTP, polimeraza DNA.

W odpowiedzi uwzględnij zastosowanie sekwencjonowania do różnych celów.

Sekwencjonowanie DNA to metoda wykorzystywana w medycynie oraz biologii molekularnej, w tym w mikrobiologii i genetyce. W medycynie sekwencjonowanie DNA jest pomocne w diagnozowaniu chorób genetycznych u ludzi (przykładowo przy pomocy sekwencjonowania DNA można zdiagnozować mukowiscydozę, chorobę Huntingtona, zespół Marfana, zespół Gilberta, achondroplazję, hemochromatozę dziedziczną). Dzięki tej metodzie można też ustalić ojcostwo lub przebadać dziecko w kierunku obecności chorób uwarunkowanych genetycznie. W biologii molekularnej sekwencjonowanie DNA używane jest do identyfikacji bakterii, wirusów oraz do poznania genów kodujących czynniki wirulencji u bakterii.

W odpowiedzi uwzględnij izolację DNA, przygotowanie DNA do sekwencjonowania, przygotowanie próbek oraz odczyt sekwencji DNA.

Etap 1. Izolacja DNA z bakterii Escherichia coli.

Etap 2. Degradacja dwuniciowego DNA do jednoniciowego DNA.

Etap 3. Dołączenie startera do jednoniciowego DNA.

Etap 4. Dodanie do mieszaniny enzymu – polimerazy DNA.

Etap 5. Polimeraza DNA jest połączona z określonymi dideoksynukleotydami: ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP.

Etap 6. Poddanie mieszaniny reakcji znakowania w 4 różnych probówkach.

Etap 7. Przeprowadzenie reakcji elektroforezy w celu pokazania nukleotydów terminalnych. 

Etap 8. Pokazanie wyników sekwencjonowania DNA na chromatogramie.

Etap 9. Poznanie sekwencji DNA i identyfikacja bakterii Escherichia coli.