• Mikroskop fluorescencyjny jest odmianą mikroskopu optycznego: także wykorzystuje promienie świetlne do wytworzenia obrazu oraz jest wyposażony w układ optyczny, ale jego działanie określają zjawiska fluorescencjifluorescencjafluorescencji i fosforescencjifosforescencjafosforescencji.

• Preparaty przygotowywane do obserwacji poddaje się działaniu barwników fluorescencyjnych (tzw. znaczników fluorescencyjnych lub fluorochromów). Obraz obiektu obserwowanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przypomina negatyw obrazu z konwencjonalnego mikroskopu optycznego: barwne struktury są widoczne na ciemnym tle.

• Mikroskopy fluorescencyjne pozwalają na takie samo maksymalne powiększenie i taką samą rozdzielczość jak mikroskopy optyczne.

• Szczególnym rodzajem mikroskopu fluorescencyjnego jest mikroskop konfokalny, wykorzystujący jako źródło promieniowania wiązkę laserową skanującą preparatpreparat mikroskopowypreparat. Obraz obserwowanego obiektu jest silnie kontrastowy – charakteryzuje się ostrymi konturami zabarwionych struktur. Ten typ mikroskopu umożliwia ponadto uzyskiwanie obrazów w formie elektronicznej, dzięki czemu mogą być one trójwymiarowe.

• Mikroskopy fluorescencyjne są szczególnie przydatne podczas obserwacji wybranych komórek lub struktur komórkowych, które wcześniej zostały zabarwione. Ta cecha mikroskopów fluorescencyjnych jest wykorzystywana m.in. w okulistyce (np. w czasie badania rogówkirogówkarogówki, podczas którego wykorzystuje się mikroskopię konfokalną). Z pomocą mikroskopów fluorescencyjnych prowadzi się również analizy ilościowe.

• Powiększony obraz badanego obiektu otrzymuje się przy użyciu oddziałującego z nią strumienia elektronów, uformowanego przez soczewki elektromagnetyczne. Rozróżnia się dwa główne rodzaje mikroskopów elektronowych: mikroskop elektronowy transmisyjny (ang. transmission electron microscope, TEM) oraz mikroskop elektronowy skaningowy (ang. scanning electron microscope, SEM).

• Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) pozwala na uzyskanie powiększenia obrazu 1 000 000 razy przy zdolności rozdzielczej na poziomie 0,2 nm. Preparat barwi się związkami metali ciężkich (np. ołowiu, uranu), aby zwiększyć kontrast struktur komórki zróżnicowanych pod względem powinowactwa do jonów tych metali. Uzyskany obraz jest dwuwymiarowy.

• Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) pozwala na obserwację trójwymiarowej topografii powierzchni przedmiotów powiększonych nawet 4 000 000 razy przy maksymalnej rozdzielczości 1 nm. Obserwowane przedmioty na całej powierzchni badanej próbki pokrywa się cienką warstwą wybranych metali szlachetnych.

• Mikroskopy elektronowe stosuje się do obserwacji struktur komórkowych, białek, wirusów i małych cząsteczek (ze względu na możliwość uzyskania bardzo dużego powiększenia i dużej rozdzielczości, a w przypadku SEM – trójwymiarowych obrazów). Mikroskopów tego rodzaju nie można jednak wykorzystać do obserwacji żywych komórek. Należy także zauważyć, że uzyskany obraz martwych struktur może odbiegać od obrazu żywych obiektów, a ponadto jest on pozbawiony naturalnej ich barwy (obiekty na zdjęciach mikroskopowych albo są przedstawione w skali szarości, albo też zostają pokolorowane już po wykonaniu fotografii).

Tkanki ludzkie i zwierzęce są bardzo delikatne i miękkie, dlatego nie ma możliwości krojenia ich bez wcześniejszego, odpowiedniego przygotowania. Tkankę należy zatopić w twardszym, łatwo skrawalnym i biochemicznie obojętnym materiale, np. parafinie. By móc całkowicie przepoić tkankę parafiną, trzeba najpierw usunąć całkowicie z niej wodę. Zbyt gwałtowne odwodnienie tkanki (pozbawienie komórek głównego składnika – wody) mogłoby doprowadzić do obkurczenia komórek i tym samym uszkodzenia preparatu. W związku z tym proces odwadniania musi zachodzić stopniowo. Skrawki umieszcza się w tzw. rosnącym szeregu alkoholowym: od etanolu o stężeniu 30%, poprzez 50%, 70%, 80%, 90%, 96% i 99,8%, do mieszaniny etanol‑ksylen i na końcu czystego ksylenu. Kolejne etapy przeprowadza się w temperaturze 52°C. By przepoić tkanki parafiną, umieszcza się je w mieszaninie ksylen‑parafina, a następnie w samej parafinie przez kilkanaście godzin. Tak przepojony skrawek umieszczany jest w metalowej formie wypełnionej parafiną.

Zatopiony we wnętrzu bloczka parafinowego materiał zostaje pokrojony na cienkie skrawki za pomocą mikrotomumikrotommikrotomu rotacyjnego. Następnie skrawki parafinowe są naklejane na uprzednio przygotowane szkiełka podstawowe. Trwałe przyklejenie skrawków trwa kilka godzin i odbywa się w cieplarce, w temperaturze 50°C. Tak przygotowany preparat jest gotowy do dalszych etapów barwienia.

RFllLy6hTGoh9

Zdjęcie przedstawia mikrotom, czyli przyrząd służący do cięcia preparatów biologicznych na bardzo cienkie skrawki do obserwacji mikroskopowej. Trzymając jedną ręką mikrotom, wsuwamy w otwór obiekt, którego skrawek chcemy wykonać. Następnie drugą ręką obracamy ostrze chwytając za specjalny uchwyt. Obcięty skrawek umieszczamy pęsetą na szkiełku podstawowym. Mikrotomy mogą być całkowicie mechaniczne. Albo jak ze zdjęcia półautomatyczne, gdzie wszelkie ustawienia i ruch ostrza są kierowane przez operatora, lub też bardzo zaawansowane, sterowane komputerowo. Tam wszystkim zawiadują podzespoły elektroniczne. Większość mikrotomów ma stalowe ostrza, ale są też mikrotomy z ostrzem szklanym czy z ostrzem diamentowym. W mikrotomach stosuje się też cięcie laserem. Mikrotom to bardzo zaawansowane urządzenie. Cięcie preparatów za jego pomocą jest dokładne, a ryzyko skaleczenia w przypadku mikrotomów sterowanych komputerowo zerowe.