Techniki mapowania genomów rozwijały się przez wiele lat. Choć obecnie pierwotne analizy wydają się być bardzo nieprecyzyjne, to wszelkie zdobyte informacje pozwoliły m.in. na ustalenie kolejności genów na chromosomach. Dane te okazały się nieocenione w momencie, w którym możliwe było sekwencjonowanie genomów. Dzięki poznanej kolejności genów łatwiejsze stało się dopasowanie sekwencjonowanych fragmentów w trakcie składania w całość sekwencji genomu ludzkiego.

Ustalenie pełnej sekwencji genomu pozwala na analizę genów związanych z chorobami czy badanie pokrewieństwa między organizmami. Poznanie sekwencji genomów innych organizmów umożliwia ustalenie ścieżki ewolucyjnej człowieka, poprzez ustalenie regionów niezmiennych ewolucyjnie. Analiza porównawcza tych regionów pozwala na odtworzenie prawdopodobnego drzewa filogenetycznego, prowadzącego do człowieka. Genomy mikroorganizmów służą np. w opracowaniu potencjalnych leków i szczepionek.

W celu scharakteryzowania genomugenom genomu ludzkiego tworzy się trzy rodzaje map: genetyczne, cytogenetyczne i fizyczne.

Rpp7l3c5iadKo

Ilustracja przedstawia cztery rodzaje map genetycznych opisane literami A, B, C i D. W pierwszym rzędzie znajduje się mapa genetyczna A w postaci długiej linii z prostokątami z literami x, y i z wewnątrz. Wskazane są na niej odległości między genami (x, y, z) na podstawie częstości crossing‑over w centymorganach. Odcinek z prostokątami ujęty jest w klamrę. W drugim rzędzie znajduje się mapa genetyczna B w postaci długiego prostokąta z zaokrąglonymi końcami i półokrągłymi wcięciami na około 2/3 jego długości. Ma ona na całej długości biało – szare, nieregularne prążki. Jest to mapa cytogenetyczna posiadająca charakterystyczny dla danego chromosomu układ prążków, w których zawarte są geny. W trzecim rzędzie znajduje się mapa genetyczna C w postaci długiej linii podzielonej na odcinki, pomiędzy którymi znajdują się litery a, b, c oraz d. Pod nimi są ułożone w trzech rzędach wąskie prostokąty z kolorowymi kwadratami wewnątrz – pod literą a kwadraty koloru pomarańczowego, pod literą b koloru zielonego, pod literą c koloru niebieskiego i pod literą d koloru fioletowego. Jest to mapa fizyczna - poznany za pomocą na przykład analizy miejsc restrykcyjnych układ sekwencji, gdzie odległości podane są w milionach lub tysiącach par zasad. W czwartym rzędzie znajduje się mapa genetyczna D w postaci długiej linii podzielonej przez prostopadłe linie na krótkie odcinki. Pod każdą z tych linii widnieją litery, kolejno: A, A, T, C, A, G, T, A, C, A, G, A, C, C, G, A, T, G, C, G, A, A, T, C, A, G, T, A, C, A. Cała linia ujęta jest na górze klamrą. Jest to sekwencja zasad fragmentu DNA.

• Mapa genetyczna – graficzne przedstawienie uporządkowania genów w cząsteczce DNA. Obejmuje zarówno kolejność położenia genów, jak i odległości między nimi. Mapy genetyczne mogą być liniowe lub koliste, w zależności od struktury odwzorowywanej cząsteczki DNA. Jednostką opisującą mapy genetyczne jest % rekombinacji wyrażany w centymorganach (cM) (1 crossing‑overcrossing‑overcrossing‑over na 100 mejoz).

• Mapa cytogenetyczna – pasmowy układ prążków charakteryzujących poszczególne chromosomy. Przedstawiana jest jako układ ciemnych i jasnych prążków, w obrębie których znajdują się sekwencje genów.

• Mapa fizyczna – powstaje poprzez wykorzystanie technik biologii molekularnej do dokładnego ustalenia sekwencji badanego DNA w genomie. Jednostką opisującą mapy fizyczne są pary zasad (pz).

R5dwBXZJ3pATr1

Czarno - białe zdjęcie przedstawia starszego mężczyznę – Fredericka Sangera. Ma on półdługie, zaczesane do tyłu włosy, niewielkie oczy z opadającymi kącikami, dość spory nos i zaciśnięte usta złożony w lekki uśmiech. Na nosie ma okulary w grubych, plastikowych oprawkach. Ubrany jest w koszulę w drobną kratkę, czarny krawat i jasną marynarkę.

Doskonalenie technik biologii molekularnej pozwoliło na dokładne określenie lokalizacji genów i sekwencji niekodujących w genomie. Ogromny wpływ na powstanie mapy genomu człowieka miało udoskonalenie technik sekwencjonowania. Na początku rozwoju technologii badań molekularnych powszechnie wykorzystywano przede wszystkim dwie metody:

• metody genetyczne – na podstawie częstości rekombinacji zachodzących między genami (w procesie crossing‑over); częstość występowania rekombinantówrekombinantrekombinantów jest odwrotnie proporcjonalna do odległości między genami (więcej informacji o przebiegu i znaczeniu crossing‑over znajduje się w materiale: Częstość crossing‑over i mapowanie genówCzęstość crossing‑over i mapowanie genów); mapy genetyczne sporządzano także na podstawie analizy rodowodów, kiedy identyfikowano dziedziczność pewnych zmian z pokolenia na pokolenie w obrębie jednej rodziny. 

• metody fizyczne – np. analiza aberracji chromosomówaberracje chromosomówaberracji chromosomów (przede wszystkim delecji, widocznych mikroskopowo) lub przez analizę efektów działania genów zmienionych mutacją.

Podczas tworzenia mapy genomu wykorzystuje się markery genetyczne. Markery to dane właściwości organizmów, pozwalające na określenie ich genotypów. Pierwotnie były to markery oparte na genach - odcinkach DNA kodujących informację o danym białku. Brak lub obecność danego genu mogła wpływać na wygląd lub funkcjonowanie organizmu. Dzięki temu możliwe było wykrycie różnic. Geny jako markery nie są jednak nadal wykorzystywane, ze względu na duże fragmenty odcinków niekodujących między nimi. Konieczne było opracowanie innych metod, opierających się na markerach molekularnych, które wykorzystują właściwości kwasów nukleinowych, głównie DNA.

Obecnie jednym z wykorzystywanych markerów w trakcie tworzenia map genetycznych jest polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism). RFLP opiera się na analizie powielonego w reakcji PCR fragmentu DNA, poddanego trawieniu restrykcyjnemu. Dzięki wysokiej specyficzności używanych enzymów restrykcyjnych możliwa jest analiza wielu próbek. Polimorfizmpolimorfizm Polimorfizm fragmentów pojawia się wtedy, gdy miejsce rozpoznawane przez enzym ulegnie zmianie. Skutkuje to brakiem cięcia sekwencji DNA i zmienionym układem analizowanych poprzez elektroforezę prążków. Więcej na ten temat znajdziesz w materiale: Analiza restrykcyjna i elektroforeza DNAAnaliza restrykcyjna i elektroforeza DNA.

Rozwój technik mapowania genomu objął także metody fizyczne. Nowe metody biologii molekularnej pozwoliły na identyfikację i ustalenie położenia genów w chromosomie za pomocą sond molekularnychsonda molekularnasond molekularnych z wykorzystaniem zjawiska hybrydyzacji DNAhybrydyzacja kwasów nukleinowych hybrydyzacji DNA. Więcej informacji o działaniu sond molekularnych znajduje się w materiale: Sondy molekularne i hybrydyzacja DNASondy molekularne i hybrydyzacja DNA.

Jedną z najczęściej stosowanych technik, służących do konstrukcji map fizycznych, jest metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH, ang. fluorescence in situ hybrydization). W metodzie FISH wykorzystywana jest sonda molekularna wyznakowana fluorescencyjnie, która łączy się z sekwencją DNA. Obserwacja pod mikroskopem fluorescencyjnym pozwala na wykrycie sygnału z sondy. Umożliwia to lokalizację badanego fragmentu w określonym miejscu chromosomu.

Opisane wyżej metody pozwalają na identyfikację i lokalizację danego genu. Kolejność ułożenia genów w chromosomie ustalona tymi sposobami jest zwykle zgodna. Istnieją jednak rozbieżności między wynikami uzyskanymi metodą fizyczną i genetyczną. W wyniku sekwencjonowaniasekwencjonowaniesekwencjonowania DNA udało się ustalić dokładną sekwencję genomu człowieka, obejmującą zarówno części kodujące (geny), jak i sekwencje niekodujące. Mapy genomów przyczyniły się do prawidłowego złożenia danych, które uzyskano w wyniku sekwencjonowania. W trakcie sekwencjonowania genomu człowieka ustalono kolejność nukleotydów we fragmentach analizowanego DNA. Te jednak musiały zostać ułożone w odpowiedniej kolejności, tworząc pełną sekwencję. Bez szczegółowej wiedzy na temat mapy genomu, to zadanie byłoby znacznie utrudnione. Ze względu na wykorzystane techniki, mapa genomu może wyglądać w różny sposób.

RKFyU2fluhjmu

Zdjęcie spod mikroskopu przedstawia kariotyp (zestaw chromosomów) kobiety, który pod wpływem wyznakowania barwnikami fluorescencyjnymi świeci się na zielono oraz czerwono. Chromosomy mają kształt litery X różnej wielkości.

Szczegółowych informacji o lokalizacji i sekwencjach genów dostarczyło sekwencjonowanie genomu. Przełomem w badaniach ludzkiego genomu były odkrycia programu Human Genome Project.

RK2huOzAuou8B1

Ilustracja przedstawia logo programu Human Genome Project, na którym widoczna jest sylwetka człowieka opleciona przez podwójną helisę DNA. Wokół niej widnieją napisy w języku angielskim, nazw dziedzin nauki: chemia, biologia, fizyka, etyka, inżynieria, informatyka.

W 1988 r. założono międzynarodową organizację Human Genome Organisation (HUGO), koordynującą współpracę wielu jednostek naukowych zajmujących się genomiką. Efektem prac naukowców było zapoczątkowanie Human Genome Project (HGP) – programu naukowego, który miał na celu poznanie sekwencji DNA ludzkiego genomu i identyfikację występujących w nim genów. Dawcami DNA do projektu były anonimowe osoby pochodzące z Europy, Afryki, Azji oraz Ameryki Północnej, Środkowej i Południowej. Planowano, że realizacja projektu zajmie 15 lat. Do badań genomu ludzkiego przystąpiła także firma Celera Genomics, w której zastosowano nową metodę polegającą na sekwencjonowaniu losowych fragmentów DNA. W 2000 r. ogłoszono, że poznano wstępny opis genomu człowieka, a dane uzyskane przez HGP i Celera Genomics opublikowano w dwóch niezależnych artykułach w czasopismach „Science” oraz „Nature”. W 2003 r. HGP i Celera opublikowały wspólny dokument stwierdzający zakończenie sekwencjonowania 99% genomu z trafnością 99,99%. Dane pochodzące z HGP są publicznie dostępne. Szacowany koszt badań to ok. 3 miliardy dolarów. Założyciel firmy Celera Genomics Craig Venter przyznał, że w projekcie wykorzystano próbkę jego DNA.

Poznanie genomu człowieka pozwoliło na oszacowanie liczby występujących w nim genów na ok. 22,3 tys. (początkowo zakładano istnienie ok. 100 tys. genów). Nadal są prowadzone badania nad identyfikacją i funkcją genów, a także publikowane analizy sekwencji poszczególnych chromosomów. Więcej informacji o wynikach programu Human Genome Project znajduje się w sekcji „Audiobook”.

Dodatkowym efektem pracy przy poznaniu sekwencji genomu ludzkiego było także poznanie sekwencji genów innych organizmów, w tym E. coli czy myszy. Dane te pozwoliły na analizę porównawczą i wyznaczenie stopnia podobieństwa między organizmami, a także ustalenie niezmiennych ewolucyjnie regionów DNA, które mogą posłużyć za narzędzie ustalania pokrewieństwa. Analiza genomu człowieka przyczyniła się także do rozwoju technik biologii molekularnej, w tym technik mapowania. Ważną kwestią okazał się także wynik badań na społeczeństwo i sprawy etyczne związane z poznaniem genomu człowieka. Publikacja wyników programu wywołała dyskusję m.in. na temat zagrożeń związanych z ingerencją w genom człowieka. 

RXT5EcIOcjOrQ

Zdjęcie przedstawia regał, który wypełniony jest ponumerowanymi segregatorami. Mają ona kolor biały. Ściana za regałem jest czerwona, z lewej strony widnieje kabina zbudowana z szyb w białej ramie, wewnątrz której znajduje się jakaś maszyna.

Słownik