Wróć do informacji o e-podręczniku Wydrukuj Pobierz materiał do PDF Pobierz materiał do EPUB Pobierz materiał do MOBI Zaloguj się, aby dodać do ulubionych Zaloguj się, aby skopiować i edytować materiał Zaloguj się, aby udostępnić materiał Zaloguj się, aby dodać całą stronę do teczki
bg‑pink

E‑materiały powiązane z tematem

bg‑pink

Tkanka mięśniowa

bg‑gray2

Tkanka mięśniowa poprzecznie prążkowana szkieletowa

Komórki tkanki mięśniowej poprzecznie prążkowanej tworzą długie, nawet kilkucentymetrowe włókna o cylindrycznym kształcie. Włókna mięśni szkieletowych są syncytiami (zespólniami) – powstają w wyniku połączenia się wielu pojedynczych komórek mięśniowych, dlatego zawierają od kilkudziesięciu do kilkuset jąder komórkowych, ułożonych na peryferiach cytoplazmy, tuż pod błoną komórkową. We włóknach występują również licznie mitochondria.

1

Miofilamenty grube i cienkie leżą równolegle wzdłuż włókna i częściowo na siebie zachodzą. Różnią się sposobem załamywania światła. Włókna miozyny mocniej załamują światło i widoczne są w postaci ciemnych fragmentów, natomiast włókna aktyny, które słabiej załamują światło, tworzą jasne odcinki. Daje to charakterystyczny efekt prążkowania widoczny pod mikroskopem.

Włókna kurczą się bardzo szybko, ale też szybko się męczą. Skurcz mięśni poprzecznie prążkowanych jest silny i zależny od woli. Tkanka mięśniowa szkieletowa cechuje się dobrym unaczynieniem i unerwieniem.

bg‑gray3

Tkanka mięśniowa poprzecznie prążkowana serca

Tkanka mięśnia sercowego zbudowana jest z włókien mięśniowych. Każde włókno składa się z wielu cylindrycznych, widlasto rozgałęzionych, jedno- lub dwujądrowych komórek, które zawierają liczne mitochondria.

1

Wewnątrz komórek, podobnie jak w mięśniu szkieletowym, można zaobserwować wyraźne prążki, ale jądra komórkowe położone są w centrum. Komórki we włóknie układają się szeregiem, jedna za drugą. Na powierzchniach ich styku obecne są wyspecjalizowane połączenia, tzw. wstawki. Włókna łączą się bocznymi odgałęzieniami z sąsiednimi włóknami, tworząc przestrzenną sieć. Zapewnia to synchronizację skurczu mięśnia sercowego, który kurczy się dość szybko, ale słabiej niż mięśnie szkieletowe – wynika to z mniejszej liczby miofibryli. Tkanka mięśniowa serca jest dobrze unaczyniona, a jej skurcze są niezależne od woli.

bg‑gray3

Tkanka mięśniowa gładka

Tkanka ta składa się z wrzecionowatych komórek mających jedno, centralnie położone jądro komórkowe. Zawiera kilkakrotnie mniej włókien kurczliwych niż pozostałe rodzaje tkanki mięśniowej (poprzecznie prążkowana szkieletowa i  poprzecznie prążkowana serca). Miofibryle zaś ułożone są nieregularnie, przez co skurcze mięśni są powolne, długotrwałe i odporne na zmęczenie. Takie ułożenie miofibryli wpływa także na brak widocznego prążkowania (stąd nazwa tej tkanki – tkanka mięśniowa gładka). Skurcze mięśni gładkich nie zależą od woli człowieka.

1
bg‑pink

Obserwacja mikroskopowa tkanek zwierzęcych

Do obserwacji struktur tkankowych i komórkowych używa się głównie mikroskopów (z gr. mikros – mały, skopeo – patrzę, obserwuję) – przyrządów optycznych pozwalających na otrzymywanie powiększonych obrazów obiektów niewidocznych gołym okiem.

Ciekawostka

Wynalezienie mikroskopu najczęściej przypisuje się dwóm Holendrom – Hansowi i Zachariaszowi Janssenom (ojcu i synowi) – którzy na przełomie XVI i XVII w. skonstruowali urządzenie składające się z dwóch soczewek zamocowanych na obu końcach rury. Przyrząd ten, zwany mikroskopem sprzężonym, pozwalał na zaledwie 10‑krotne powiększenie obserwowanego obiektu. Obserwacja komórek stała się możliwa nieco później – w połowie XVII w. – dzięki wynalezieniu mikroskopu optycznego (świetlnego) przez angielskiego przyrodnika i eksperymentatora Roberta Hooke’a (1635–1703).

Współcześnie najczęściej stosowanymi mikroskopami są: mikroskopy optyczne (świetlne), mikroskopy fluorescencyjne oraz mikroskopy elektronowe.

Mikroskopy optyczne (świetlne)
  • Do wytworzenia obrazu badanego obiektu i jego powiększenia wykorzystywane są promienie świetlne, które docierają do układu optycznego, tworzonego przez zestaw soczewek optycznych umieszczonych w obiektywie i okularze. Niektóre elementy układu optycznego są ruchome, dzięki czemu można tak manipulować wytworzonym obrazem, aby był optymalnie wyraźny.

  • Najnowocześniejsze mikroskopy optyczne pozwalają na osiągnięcie 1500‑krotnego powiększenia, przy maksymalnej rozdzielczości na poziomie 0,2 µm.

  • Mikroskopy optyczne są bardzo przydatne w badaniach biologicznych: pozwalają na obserwację zarówno żywych komórek (ich ruchu lub procesów w nich zachodzących, np. podziałów komórkowych), jak i martwych komórek (w tym celu sporządza się z nich preparaty, po uprzednim utrwaleniu i wybarwieniu).

  • Szczególnym rodzajem mikroskopu optycznego jest mikroskop kontrastowo‑fazowy, którego działanie opiera się na zjawisku interferencjiinterferencja falinterferencji fal świetlnych i przesunięcia fazowegoprzesunięcie fazoweprzesunięcia fazowego światła przy przejściu przez obserwowany preparat, dzięki czemu pozwala na obserwację żywych, nieutrwalonych preparatów biologicznych.

Mikroskopy fluorescencyjne
  • Mikroskop fluorescencyjny jest odmianą mikroskopu optycznego: także wykorzystuje promienie świetlne do wytworzenia obrazu oraz jest wyposażony w układ optyczny, ale jego działanie określają zjawiska fluorescencjifluorescencjafluorescencjifosforescencjifosforescencjafosforescencji.

  • Preparaty przygotowywane do obserwacji poddaje się działaniu barwników fluorescencyjnych (tzw. znaczników fluorescencyjnych lub fluorochromów). Obraz obiektu obserwowanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przypomina negatyw obrazu z konwencjonalnego mikroskopu optycznego: barwne struktury są widoczne na ciemnym tle.

  • Mikroskopy fluorescencyjne pozwalają na takie samo maksymalne powiększenie i taką samą rozdzielczość jak mikroskopy optyczne.

  • Szczególnym rodzajem mikroskopu fluorescencyjnego jest mikroskop konfokalny, wykorzystujący jako źródło promieniowania wiązkę laserową skanującą preparatpreparat mikroskopowypreparat. Obraz obserwowanego obiektu jest silnie kontrastowy – charakteryzuje się ostrymi konturami zabarwionych struktur. Ten typ mikroskopu umożliwia ponadto uzyskiwanie obrazów w formie elektronicznej, dzięki czemu mogą być one trójwymiarowe.

  • Mikroskopy fluorescencyjne są szczególnie przydatne podczas obserwacji wybranych komórek lub struktur komórkowych, które wcześniej zostały zabarwione. Ta cecha mikroskopów fluorescencyjnych jest wykorzystywana m.in. w okulistyce (np. w czasie badania rogówkirogówkarogówki, podczas którego wykorzystuje się mikroskopię konfokalną). Z pomocą mikroskopów fluorescencyjnych prowadzi się również analizy ilościowe.

Mikroskopy elektronowe
  • Powiększony obraz badanego obiektu otrzymuje się przy użyciu oddziałującego z nią strumienia elektronów, uformowanego przez soczewki elektromagnetyczne. Rozróżnia się dwa główne rodzaje mikroskopów elektronowych: mikroskop elektronowy transmisyjny (ang. transmission electron microscope, TEM) oraz mikroskop elektronowy skaningowy (ang. scanning electron microscope, SEM).

  • Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) pozwala na uzyskanie powiększenia obrazu 1 000 000 razy przy zdolności rozdzielczej na poziomie 0,2 nm. Preparat barwi się związkami metali ciężkich (np. ołowiu, uranu), aby zwiększyć kontrast struktur komórki zróżnicowanych pod względem powinowactwa do jonów tych metali. Uzyskany obraz jest dwuwymiarowy.

  • Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) pozwala na obserwację trójwymiarowej topografii powierzchni przedmiotów powiększonych nawet 4 000 000 razy przy maksymalnej rozdzielczości 1 nm. Obserwowane przedmioty na całej powierzchni badanej próbki pokrywa się cienką warstwą wybranych metali szlachetnych.

  • Mikroskopy elektronowe stosuje się do obserwacji struktur komórkowych, białek, wirusów i małych cząsteczek (ze względu na możliwość uzyskania bardzo dużego powiększenia i dużej rozdzielczości, a w przypadku SEM – trójwymiarowych obrazów). Mikroskopów tego rodzaju nie można jednak wykorzystać do obserwacji żywych komórek. Należy także zauważyć, że uzyskany obraz martwych struktur może odbiegać od obrazu żywych obiektów, a ponadto jest on pozbawiony naturalnej ich barwy (obiekty na zdjęciach mikroskopowych albo są przedstawione w skali szarości, albo też zostają pokolorowane już po wykonaniu fotografii).

Więcej na temat mikroskopów i mechanizmów ich działania w e‑materiale Rodzaje mikroskopów używanych w badaniach biologicznychPMvl58tTBRodzaje mikroskopów używanych w badaniach biologicznych

W obserwacji mikroskopowej komórki i ich elementy nie wykazują różnic w absorpcji promieniowania elektromagnetycznego, co przekłada się na brak wyraźnego kontrastu między poszczególnymi elementami. Nie ma więc możliwości rozróżnienia szczegółów budowy danej tkanki czy też elementów komórki. Z tego powodu w preparatach mikroskopowych niezbędne jest zastosowanie barwników histologicznych, które wybarwiają komórki wraz z ich elementami strukturalnymi, a tym samym umożliwiają ich dokładną obserwację i identyfikację.

bg‑pink

Barwniki histologiczne

Barwniki histologiczne to związki chemiczne wykorzystywane w mikroskopii świetlnej do wybarwiania struktur komórkowych i tkankowych. Typowy barwnik zawiera dwie grupy chemiczne: chwytną i barwną. Część chwytna łączy się z elementami komórkowymi o określonym składzie chemicznym, natomiast barwna absorbuje światło o określonej długości fali, dzięki czemu możliwe jest dostrzeżenie wybarwionych struktur.

W zależności od struktury, jaką się będzie obserwować, należy zastosować odpowiedni barwnik histologiczny.

Poniżej przedstawiono przykładowe metody barwienia preparatów histologicznych.

R1ZyzEGqO7rq11
Wybrane metody barwienia preparatów histologicznych.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
bg‑gray3

Hematoksylina i eozyna

Najczęściej stosowanymi barwnikami w histologii są hematoksylinahematoksylinahematoksylina oraz eozynaeozynaeozyna (H+E).

  • Hematoksylina to niebieski barwnik, którym wykrywa się kwasowe (zasadochłonne) elementy komórki, takie jak jądro komórkowe czy siateczka śródplazmatyczna szorstka. Zazwyczaj stosowana jest w połączeniu z eozyną.

  • Eozyna to kwasowy barwnik o czerwonej barwie służący do wykrywania zasadowych (kwasochłonnych) struktur komórkowych, takich jak cytoplazma i włókna kolagenowe.

bg‑pink

Przygotowanie preparatu mikroskopowego

Pobieranie tkanki i jej utrwalenie

Po uzyskaniu zgody odpowiedniej komisji bioetycznej rozpoczyna się procedura pobierania materiału tkankowego. Zazwyczaj izolowane są całe narządy. Po wycięciu materiał od razu umieszczany jest w płynie utrwalającym, w celu uniknięcia zmian degeneracyjnychdegeneracjadegeneracyjnych. Utrwalacze zawierają w swoim składzie m.in.: formaldehyd, chloroform, kwas octowy, sole rtęci i chromu. Czas utrwalania zależny jest od rodzaju pobranej tkanki, jej wielkości oraz rodzaju użytego utrwalacza. Jednak przyjmuje się, że średni czas utrwalania tkanki powinien wynosić ok. 12 godzin. Zbyt krótki czas utrwalania może skutkować nieprawidłowym obrazem mikroskopowym, a zbyt długi – spowodować kruchość materiału.

Odwadnianie i zatapianie materiału

Tkanki ludzkie i zwierzęce są bardzo delikatne i miękkie, dlatego nie ma możliwości krojenia ich bez wcześniejszego, odpowiedniego przygotowania. Tkankę należy zatopić w twardszym, łatwo skrawalnym i biochemicznie obojętnym materiale, np. parafinie. By móc całkowicie przepoić tkankę parafiną, trzeba najpierw usunąć całkowicie z niej wodę. Zbyt gwałtowne odwodnienie tkanki (pozbawienie komórek głównego składnika – wody) mogłoby doprowadzić do obkurczenia komórek i tym samym uszkodzenia preparatu. W związku z tym proces odwadniania musi zachodzić stopniowo. Skrawki umieszcza się w tzw. rosnącym szeregu alkoholowym: od etanolu o stężeniu 30%, poprzez 50%, 70%, 80%, 90%, 96% i 99,8%, do mieszaniny etanol‑ksylen i na końcu czystego ksylenu. Kolejne etapy przeprowadza się w temperaturze 52°C. By przepoić tkanki parafiną, umieszcza się je w mieszaninie ksylen‑parafina, a następnie w samej parafinie przez kilkanaście godzin. Tak przepojony skrawek umieszczany jest w metalowej formie wypełnionej parafiną.

Krojenie i przyklejanie skrawków

Zatopiony we wnętrzu bloczka parafinowego materiał zostaje pokrojony na cienkie skrawki za pomocą mikrotomumikrotommikrotomu rotacyjnego. Następnie skrawki parafinowe są naklejane na uprzednio przygotowane szkiełka podstawowe. Trwałe przyklejenie skrawków trwa kilka godzin i odbywa się w cieplarce, w temperaturze 50°C. Tak przygotowany preparat jest gotowy do dalszych etapów barwienia.

RFllLy6hTGoh9
Mikrotom.
Źródło: Pixabay, domena publiczna.
bg‑gray2

Odparafinowanie i nawodnienie materiału

  • 2 × 5 min w ksylenie (rozpuszcza parafinę)

  • 2 × 3 min w etanolu 99,8%

  • 1 × 3 min w etanolu 96%

  • 1 × 3 min w etanolu 90%

  • 1 × 3 min w etanolu 80%

  • 1 × 3 min w etanolu 70%

  • 1 × 3 min w etanolu 50%

  • 1 × 3 min w etanolu 30%

  • 1 × 3 min w dHIndeks dolny 2O

bg‑gray2

Barwienie hematoksyliną i eozyną

  • Zanurz skrawki na 3 minuty w wodzie destylowanej.

  • Umieść skrawki na 5 minut w roztworze hematoksylinyhematoksylinahematoksyliny.

  • Przebarwione skrawki odbarw przez 2–3 sekundy w zakwaszonym alkoholu (0,25 ml HCl na 100 ml alkoholu 70%).

  • Przepłucz skrawki pod bieżącą wodą i skontroluj ich jakość pod mikroskopem.

  • Zanurz skrawki na minutę w roztworze eozynyeozynaeozyny.

  • Przepłucz je wodą destylowaną.

bg‑gray2

Odwadnianie i zamykanie preparatów

  • 1 × 5 min w etanolu 96%

  • 2 × 5 min w etanolu 100%

  • 2 × 10 min w ksylenie (wcześniej usuń nadmiar etanolu)

  • Zamknij preparat w kropli DPX (nie osuszaj preparatu z ksylenu).

  • Susz preparat w 37°C przez noc lub 2 godziny w 45°C.

bg‑gray2

Wyniki barwienia

Elementy zasadochłonne (np. jądra komórkowe) barwią się na niebiesko, a elementy kwasochłonne na czerwono.

  • Jądra komórkowe – chromatyna: niebieska

  • Cytoplazma: różowa

  • Tkanka łączna: szarofioletowa

Słownik

barwienie
barwienie

zespół metod mających na celu wizualizację określonych struktur, elementów komórkowych lub identyfikację związków chemicznych w materiale roślinnym lub zwierzęcym; barwienie preparatów mikroskopowych dokonuje się przez naniesienie barwnika (związku chemicznego) na szkiełko mikroskopowe

degeneracja
degeneracja

proces patologiczny, zmiana polegająca na uszkodzeniu narządu lub tkanki

eozyna
eozyna

bromowa pochodna fluoresceiny; wykazuje właściwości kwasowe i dlatego ma silniejsze powinowactwo do elementów komórki o charakterze kwasochłonnym; stosowana jest m.in. w metodzie barwienia Giemsy; elementy komórkowe zasadochłonne, w tym jądra komórkowe, wybarwiają się na kolor niebieski, a kwasochłonne na kolor czerwony

faza fali
faza fali

wartość stosowana do opisu zjawisk okresowych; określa stan ruchu w danej chwili

fluorescencja
fluorescencja

zjawisko polegające na emitowaniu fal świetlnych przez cząsteczkę fluorochromu wzbudzoną światłem o właściwej długości fali

fosforescencja
fosforescencja

rodzaj fotoluminescencjifotoluminescencjafotoluminescencji; zanika w stosunkowo długim czasie (w porównaniu z fluorescencjąfluorescencjafluorescencją)

fotoluminescencja
fotoluminescencja

luminescencja zachodząca w wyniku powrotu do stanu podstawowego cząsteczek lub atomów wzbudzonych do wyższych stanów elektronowych promieniowaniem elektromagnetycznym (zakresu widzialnego i nadfioletu)

hematoksylina
hematoksylina

pozyskiwana jest z drewna modrzejca kampechiańskiego (Erythroxylon campechianum); w jej składzie wyróżnić można roztwory soli żelaza, glinu, wolframu i chromu; dzięki jonom metalu elementy komórkowe chłoną barwnik, co uwidocznione jest na preparacie szkiełkowym; aby hematoksylina miała zdolność do wybarwiania jądra komórkowego, konieczny jest proces utleniania barwnika (co wykonuje się w warunkach laboratoryjnych za pomocą np. światła słonecznego lub substancji chemicznych)

interferencja fal
interferencja fal

zjawisko fizyczne nakładania się dwóch (lub więcej) fal, przy którym w różnych punktach przestrzeni następuje wzmacnianie lub osłabianie amplitudy fali wypadkowej

mikrotom
mikrotom

przyrząd do cięcia tkanek na cienkie skrawki, z których sporządza się preparaty mikroskopowe; skrawki mają grubość ok. 0,1–20 µm (do mikroskopów optycznych) lub 0,03–0,1 µm (do mikroskopów elektronowych)

preparat mikroskopowy
preparat mikroskopowy

obiekty biologiczne przygotowywane w specjalny sposób do analizy podczas obserwacji mikroskopowej; każdy rodzaj mikroskopu wymaga odmiennego sposobu wykonania preparatu

przesunięcie fazowe
przesunięcie fazowe

różnica pomiędzy wartościami fazyfaza falifazy dwóch fal, np. świetlnych

rogówka
rogówka

przezroczysta przednia część błony zewnętrznej oka kręgowców, właściwa także dla człowieka