Aby prześledzić ewolucję gatunków, można przyglądać się np. skamieniałym szkieletom, jakie po nich pozostały. W ten sposób ustalono, że współczesne ptaki pochodzą od dinozaurów. Co więcej, można je zaklasyfikować do jednej z grup tych wielkich gadów i uznać za ich jedynych żyjących dziś przedstawicieli. Więcej informacji na ten temat znajdziesz w e‑materiale: Czy ptaki są dinozaurami?D16uDEgVYCzy ptaki są dinozaurami? Obecnie tworzone drzewa pokrewieństw między organizmami opierają się na analizie genomów organizmów. Rozwój technik pozwalających na badania DNA zrewolucjonizował nauki biologiczne, a systematyka organizmów uległa znacznej zmianie.

Analizy fenotypoweanalizy fenotypoweAnalizy fenotypowe są niedostatecznym źródłem wiedzy w przypadku ustalania pokrewieństwa. Cechy, na których opiera się analiza, mogły się  wykształcić w sposób niezależny u różnych organizmów. Duży wpływ na fenotyp organizmu mają także warunki środowiska. Wiąże się z tym zjawisko plastyczności fenotypu - na podstawie danego genotypu mogą powstać różne cechy fenotypowe, w zależności od działających na organizm czynników środowiskowych. Trudne jest także ustalenie pokrewieństwa na wczesnych etapach rozwoju, ze względu na słabo wykształcone cechy specyficzne dla gatunku. Dlatego w przypadku analiz pokrewieństwa niezmiernie ważne są analizy genomów organizmów. Analizy porównawcze sekwencji genomów dostarczają wielu informacji i często podważają wyniki uzyskane na podstawie obserwacji fenotypowej. Uzyskane sekwencje są archiwizowane w bazach danych, a programy komputerowe pozwalają na ich szybkie porównywanie oraz wyszukiwanie podobieństw. Specjalistyczne narzędzia służą także do tworzenia drzew pokrewieństw oraz ustalania tempa zmian materiału genetycznego na przestrzeni lat.  Problemem, który znacząco ogranicza zakres wykorzystania analiz DNA, jest brak możliwości uzyskania prób materiału genetycznego od dawno wymarłych organizmów roślin i zwierząt.

R1ZBpOpN9R15e1

Ilustracja przedstawia wynik sekwencjonowania DNA metodą Sangera. Sekwencje ukazano w postaci czterech pionowych pasków oznaczonych kolejno jako A, T, G, C. Na pionowych paskach są gdzieniegdzie poziome ciemniejsze paski - odcinki. Litery z prawej strony przedstawiają kolejność czterech przykładowych nukleotydów we wskazanym fragmencie sekwencji DNA badanych organizmów. Są to od góry: T, A, G, C.

Aby móc przeanalizować pokrewieństwo organizmów na podstawie DNA oraz  wyciągnąć wnioski o pokrewieństwie gatunków, należy zsekwencjonowaćsekwencjonowanie DNAzsekwencjonować materiał genetyczny. Po pozyskaniu próbki od danego organizmu należy wyizolować jego materiał genetyczny. DNA organizmu może zostać powielony w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, ang. polymerase chain reaction), w wyniku czego w próbce będzie  się znajdować wiele kopii DNA.

Więcej na temat PCR w e‑materiale: Łańcuchowa reakcja polimerazy.

Taki materiał, o odpowiednim stężeniu oraz czystości, można wykorzystać do sekwencjonowania. Poznaną sekwencję można porównać z analogiczną obecną u innych organizmów i na tej podstawie określić, gdzie występują różnice. Im mniej różnic, tym bardziej podobne są dwa organizmy. Naukowcy wybrali kilka genów, które szczególnie dobrze poznali, i to właśnie one są najczęściej ze sobą porównywane

Jedną z pierwszych technik pozwalających na sekwencjonowanie DNA była metoda Sangera, opierająca się na znakowanychznakowany nukleotydznakowanych formach nukleotydów, które powodowały zakończenie syntezy nici. Dzięki analizie elektroforetycznejelektroforezaelektroforetycznej możliwy jest rozdział cząsteczek na podstawie wielkości fragmentu DNA. Podczas elektroforezy najkrótsze fragmenty migrują najszybciej, a wyznakowanie nukleotydów pozwala na określenie, który nukleotyd kończy nić. Odczyt sekwencji polegał na prześledzeniu rozdziału prążków. Obecnie cały proces został zautomatyzowany, co pozwala na analizę większych fragmentów DNA w krótszym czasie. Szczegółowe informacje na temat elektroforezy DNA znajdują się w materiale: Sekwencjonowanie DNA.

Znakowanie fluorescencyjne nukleotydów hamujących wydłużanie DNA

Dla rozwoju metod sekwencjonowania DNA niezmiernie ważne było opracowanie techniki w oparciu o znakowanie fluorescencyjne. Pozwoliło znacznie przyspieszyć sam proces i go zautomatyzować. Ponieważ różne fluorochromyfluorochromfluorochromy mają odmienne długości fal emisji po wzbudzeniu, możliwa jest obserwacja różnych kolorów fluorescencji. Ta cecha została wykorzystana w metodzie automatycznego sekwencjonowania. DideoksynukleotydydideoksynukleotydDideoksynukleotydy (ddNTP) wyznakowano bowiem różnymi fluorochromami, co pozwoliło na sekwencjonowanie z użyciem wszystkich czterech ddNTP w jednej probówce. W związku z tym wykorzystuje się jedną mieszaninę substratów reakcji, a nie jak w metodzie Sangera cztery probówki, gdzie każda miała inny rodzaj ddNTP. W technice tej wykorzystuje się detektor, mający zdolność do zbierania i odróżniania sygnałów płynących z fluorochromów.

Znakowanie fluorescencyjne opiera się na elektroforezie kapilarnej w automatycznym sekwenatorze. Wykonywana jest ona w kwarcowych kapilarach o średnicy 25–100 mikrometrów. Na ich końcu znajduje się wspomniany detektor. Sekwencja dzięki różnym sygnałom fluorochromów może być odczytywana przez komputer „na bieżąco”, co chroni przed pomyleniem kolejności prążków na żelu, zdarzającym się w tradycyjnej metodzie Sangera. Wynik takiego sekwencjonowania to chromatogramchromatogramchromatogram, na którym widoczne są piki dla poszczególnych nukleotydów, wyznakowanych różnymi fluorochromami.

R10HylcgCpF0t

Na ilustracji jest fragment chromatogramu. Ma postać czterech krzywych z licznymi odchyleniami w górę i w dół. Krzywe przeplatają się ze sobą. Mają kolory: czarny, czerwony, niebieski, zielony. Nad krzywymi są litery alfabetu A, G, T i C oznaczające sekwencję genu.

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS, ang. new generation sequencing)

Sekwencjonowanie NGS pozwala na sekwencjonowanie DNA pobranego np. z próbki gleby czy wody. Wiąże się to z ogromną ilością różnych sekwencji DNA, które są odczytywane w tym samym czasie. W wielu przypadkach poznajemy nieznane wcześniej nauce gatunki.

Sekwencjonowanie nie odbywa się w probówce, ale na płytce, na powierzchni której znajdują się dołki. DNA w dołku jest powielane przy użyciu reakcji PCR, tworząc zbiór fragmentów. W technice tej stosuje się wyznakowane fluorescencyjnie nukleotydy. Każdy z nukleotydów wyznakowany jest innym kolorem, co umożliwia ustalenie, jaki nukleotyd został przyłączony. Cykl taki powtarza się do 200 razy, aby otrzymać całkowitą sekwencję fragmentu. W tym samym czasie analizowana jest ogromna liczba próbek, która daje od 1 mln do 43 mld sekwencji na analizę. Wyniki odczytów są później analizowane przez programy komputerowe.

Głównymi zaletami najnowszych metod sekwencjonowania są:

• wysoka przepustowość;

• niski koszt analizy jednej próbki;

• możliwość analizy ogromnej ilości danych w stosunkowo krótkim czasie (technologie NGS generują dużą liczbę wyników, które następnie należy przetwarzać, wykorzystując innowacyjne narzędzie bioinformatyczne oraz komputery charakteryzujące się dużą mocą obliczeniową);

• odstąpienie od radioaktywnych izotopów i zastąpienie ich nukleotydami znakowanymi fluorescencyjnie;

• skrócenie czasu całego procesu, dzięki czemu większa ilość materiału może zostać przeanalizowana i wprowadzona do ogólnodostępnych baz danych, a na ich podstawie można następnie próbować ustalić stopień pokrewieństwa badanych organizmów z już znanymi gatunkami, lub stwierdzić, iż próbka materiału genetycznego pochodzi z jeszcze nieznanego gatunku.

Poznany za pomocą sekwencjonowania ciąg nukleotydów w badanym DNA jest wprowadzany do bazy danych. Współcześnie istnieje wiele takich baz. Gromadzą one informacje o genomach wielu gatunków lub wybranych grup organizmów, np. drożdży, bakterii czy roślin. Bazy danych pozwalają nie tylko na sprawdzenie, czy w genomie danego organizmu występuje dana sekwencja, ale także na poznanie białka, które jest przez nią kodowane.

Ustalanie pokrewieństwa między organizmami opiera się na analizie porównawczej sekwencji genomów organizmów. W toku ewolucji w DNA organizmów pojawiają się mutacje, ale w jednych jego fragmentach występują częściej, a w innych rzadziej. Sekwencje, w których rzadko dochodzi do mutacji, określane są mianem konserwatywnych i to ich używa się najczęściej do tego rodzaju porównań. Zazwyczaj sekwencje konserwatywne kodują bardzo ważne dla przeżycia komórki białka. Do analiz porównawczych wykorzystywane są także sekwencje aminokwasowe białek. Część zmian w genach nie skutkuje bowiem zmianą kodowanych przez nie aminokwasów, przez co białka utrzymują wysoki stopień podobieństwa.

RhJ2FraP3GYJh

Ilustracja przedstawia fragment analizy porównawczej sekwencji białkowej między wieloma organizmami. Zawiera duża liczbę danych zapisanych rzędami. W środkowej części zapis w rzędach tworzy długą sekwencję liter w kolorach czerwonym, zielonym, niebieskim, różowym. Po prawej stronie rzędów są cyfry.

Wyniki analizy porównawczej pozwalają na określenie stopnia podobieństwa porównywanych sekwencji, a na tej podstawie można wykonać drzewo filogenetycznedrzewo filogenetycznedrzewo filogenetyczne. Im większy stopień homologiihomologiahomologii, tym bliżej spokrewnione powinny być organizmy. W celu dokładnego określenia stopnia pokrewieństwa należy porównać długie sekwencje. Porównanie krótkich fragmentów może dać błędny wynik.

Analiza pokrewieństwa w obrębie taksonów (blisko spokrewnionych organizmów) może się opierać na krótkich fragmentach. W takim przypadku wykorzystywany jest tzw. barkoding. Więcej o metodzie barkodingu w materiale: Barkoding DNA - analiza tekstu naukowegoD12DMyz4jBarkoding DNA - analiza tekstu naukowego.

Do tworzenia drzew filogenetycznych wykorzystywane są programy komputerowe oraz narzędzia dostępne bezpośrednio w bazach danych, gromadzących informacje o sekwencjach DNA. Jedną z najczęściej używanych baz danych jest NCBI (ang. National Center for Biotechnology Information). Na stronie internetowej NCBI znajduje się specjalna zakładka poświęcona taksonomii oraz ustalaniu homologii. Do analizy można użyć danych zawartych w bazie, jak również własnych wyników. Drzewa filogenetyczne wykonane w różnych programach mogą się jednak różnić, ze względu na różne modele wykorzystywane do analiz. Więcej na ten temat znajdziesz w e‑materiale: Kontruowanie drzew filogenetycznychDcfzpE8A5Kontruowanie drzew filogenetycznych.

Do analizy pokrewieństwa często wykorzystywany jest rRNA - rybosomalny RNA, który wchodzi w skład podjednostek rybosomalnych. Szczególnie często stosowany jest fragment 16S podjednostki rybosomalnej, który jest wysoce konserwatywny. Jest to jedynie jedna z wielu cząsteczek, służących ustalaniu pokrewieństwa. Różne grupy organizmów mogą wykazywać większą zmienność w obrębie innych cząsteczek.  Przykładem porównywanej sekwencji konserwatywnej jest mitochondrialny gen kodujący cytochrom ccytochrom ccytochrom c, który mają rośliny, zwierzęta i wiele mikroorganizmów. U blisko spokrewnionych organizmów jest on bardzo podobny lub nawet identyczny, np. u ludzi i szympansów. Między dalszymi krewnymi różni się proporcjonalnie do stopnia pokrewieństwa. Jeżeli w wyizolowanym materiale genetycznym znajdzie się ten właśnie gen, to można z bardzo dużym prawdopodobieństwem ustalić taksonomiczną pozycję badanego organizmu.

Początków drzewa filogenetycznego upatruje się w hipotetycznym organizmie nazwanym z jęz. ang. last universal common ancestor (LUCA), co oznacza 'ostatni uniwersalny wspólny przodek'. Nie był to pierwszy żywy organizm na Ziemi, ale ostatni, od którego pochodzą wszystkie pozostałe. Jeśli wyobrazimy sobie pierwsze organizmy jako pień drzewa życia, LUCA będzie ostatnim z nich przed pierwszym rozgałęzieniem pnia. Zdaniem naukowców był to jednokomórkowiec podobny do dzisiejszych archeonów.

R1MC2lK3I8Xaw

Grafika przedstawia drzewo filogenetyczne, w którym od pierwszego wspólnego przodka (Luca) odchodzą trzy gałęzie: bakterie, archeony i eukarionty. Gałąź od dołu w bakteriach ma następujące nazwy: Aquifex, Termotonga, Chloroflexi, Bacteroides Cytophaga, Gram‑dodatnie, Planctomyces, sinice, proteobakterie, krętki. Gałąź archeonów od dołu: Pyrodicticum, Thermoproteus, Thermococcus celer, Methanococcus, Methanobacterium, Methanosarcina, halobakterie. Gałąź eukariontów od dołu: lambliowate, mukrosporydia, rzęsistki, wiciowce, orzęski, pełzaki, śluzowce, rośliny, zwierzęta, grzyby.

Słownik