bg‑turquoise

Synteza nici DNA

Replikacja DNA zachodzi w jądrze komórkowym, stąd można je określić „fabryką DNA”.  Proces ten odbywa się w fazie S interfazy. Chromatyna występuje wtedy w postaci rozluźnionych włókien, co umożliwia aktywność replikacyjną.

Jądro komórkowe jest przystosowane do replikacji DNA pod względem budowy, zawiera bowiem pory w otoczce jądrowej, którymi do wnętrza jądra przedostają się:

  • trifosforany nukleozydów niezbędne do produkcji nici DNA;

  • enzymy katalizujące replikację.

DNA, czyli kwas deoksyrybonukleinowy, zbudowany jest z nukleotydównukleotydnukleotydów składających się z pięciowęglowego cukru deoksyrybozy, reszty fosforanowej(V) oraz jednej z czterech zasad azotowych: adeniny (A), cytozyny (C), guaniny (G) lub tyminy (T).

Nukleotydy połączone są wiązaniem 3′,5′-fosfodiestrowymwiązanie fosfodiestrowewiązaniem 3′,5′-fosfodiestrowym, które występuje między deoksyrybozą jednego nukleotydu a resztą fosforanową kolejnego nukleotydu. W ten sposób układają się one w łańcuch polinukleotydowy, którego koniec w pozycji 5′ tworzy reszta fosforanowa(V), natomiast na końcu 3′ występuje grupa hydroksylowa (-OH) deoksyrybozy.

1

Za tworzenie nici DNA odpowiada enzym polimeraza DNApolimeraza DNApolimeraza DNA, który bierze udział w procesie replikacji DNA. Tworzenie nowej nici DNA zachodzi zawsze na matrycymatrycamatrycy, którą jest nić pochodząca z macierzystej (powielanej) cząsteczki DNA. Aby mogło zajść niezbędne jest więc rozdzielenie nici budujących cząsteczkę DNA poprzez zerwanie wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi obydwu nici, za co jest odpowiedzialny enzym helikaza. Następnie prymaza dołącza krótkie odcinki nukleotydów RNA, do których może przyłączyć się polimeraza DNA. Proces replikacji polega na dołączeniu nowego nukleotydu do końca 3′ nici, na którym występuje nukleotyd z wolną grupą OH przy węglu 3 deoksyrybozy, więc nowa nić powstaje w kierunku od 5′ do 3′.

Reakcja tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy nukleotydami wymaga dostarczenia energii z hydrolizy wiązań wysokoenergetycznych cząsteczki trifosforanu nukleozydutrifosforan nukleozydutrifosforanu nukleozydu. To właśnie w takiej formie nukleotydy są wykorzystywane do syntezy DNA, podczas której hydrolizie ulegają wiązania wysokoenergetyczne pomiędzy resztami fosforanowymi wbudowywanej cząsteczki. W konsekwencji od trifosforanu nukleozydu uwalniane są dwie reszty fosforanowe, a trzecia stanowi element budowy szkieletu cząsteczki DNA, czyli nukleotydu.

RphzOKM0hqmVp1
Schemat przedstawia dołączanie kolejnych nukleotydów do końca 3 prim poprzedniego nukleotydu. Wydłużanie łańcucha polinukleotydowego zachodzi w kierunku od końca 5 prim do końca 3 prim. W dolnej części schematu znajduje się strzałka kierowana w prawą stronę pokazująca kierunek wydłużania od 5 prim do 3 prim. Na dole, po lewej stronie schematu znajduje się koniec 5 prim, to jest reszta fosforanowa połączona z grupą CH2 5 prim, która to łączy się z pierścieniem deoksyrybozy w pozycji 4 prim. Pozycja 1 prim podstawiona jest pierścieniem cytozyny. Pozycja 3 prim łączy się z kolejną resztą fosforanową związaną z grupą CH2 5 prim, co stanowi wiązanie 3 prim, 5 prim-fosfodiestrowe. Wspomniana grupa CH2 łączy się z pierścieniem deoksyrybozy w pozycji 4 prim. Pierścień ten jest podstawiony w pozycji 1 prim tyminą, w pozycji 3 prim ponownie łączy się z resztą fosforanową związaną z grupą CH2 5 prim, która to łączy się w pozycji 4 prim z pierścieniem deoksyrybozy. Pierścień ten podstawiony jest w pozycji 3 prim grupą hydroksylową, a w pozycji 1 prim pierścieniem cytozyny. Cytozna to 4-amino-1H-pirymidin-2-on stanowi go sześcioczłonowy pierścień, który zbudowany jest z atomu azotu w pozycji pierwszej związanego za pomocą wiązania pojedynczego z atomem węgla C2 połączonym za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązania pojedynczego z atomem azotu, który to łączy się za pomocą wiązania podwójnego z atomem węgla podstawionym grupą aminową i połączonym za pomocą wiązania pojedynczego z atomem węgla związanym za pomocą wiązania podwójnego z atomem węgla C6, który to łącząc się wiązaniem pojedynczyn z atomem azotu w pozycji pierwszej zamyka pierścień. Tymina to 5-metylopirymidyno-2,4(1H,3H)-dion stanowi go sześcioczłonowy pierścień, który zbudowany jest z atomu azotu w pozycji pierwszej związanego za pomocą wiązania pojedynczego z atomem węgla C2 połączonym za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązania pojedynczego z atomem azotu, który to łączy się za pomocą pojedynczego z atomem węgla połączonym za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązania pojedynczego z atomem węgla, który to podstawiony jest grupą metylową i który to łączy się za pomocą wiązania podwójnego z atomem węgla C6 związanym za pomocą wiązania pojedynczego z atomem azotu w pozycji pierwszej, co zamyka pierścień.
Schemat przedstawia dołączanie kolejnych nukleotydów do węgla 3' poprzedniego nukleotydu. Wydłużanie łańcucha polinukleotydowego zachodzi w kierunku od 5' do 3'.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
bg‑turquoise

Tworzenie cząsteczki DNA de novo

W przeciwieństwie do syntezy DNA u żywych organizmów na drodze replikacji, w sztucznych systemach do syntezy DNA niepotrzebne jest matrycowe DNA. Nukleotydy są przyłączane do siebie bezpośrednio dzięki wywołaniu odpowiednich reakcji chemicznych. Metoda ta pozwala na syntezę praktycznie każdej, dowolnej sekwencji DNA.

Tworzenie cząsteczki DNA de novo zachodzi w dwóch etapach. Pierwszy to tzw. drukowanie DNA, które prowadzi do wytworzenia oligonukleotydówoligonukleotydyoligonukleotydów o długości ok. 200 par zasad. Drugi etap polega na połączeniu tych fragmentów różnymi metodami np. przy użyciu ligaz DNAligaza DNAligaz DNA.

Co ciekawe, w trakcie syntezy oligonukleotydów łańcuch DNA rośne w kierunku odwrotnym niż podczas biosyntezy DNA. Kolejne nukleotydy przyłączane są końcem 3′ do końca 5′. W miejscu 5′-OH nukleotydy posiadają grupę ochronną – np. grupę dimetoksytrytylową (DMTr). Jest ona chemicznie usuwana tuż przed dodaniem kolejnego nukleotydu, dzięki czemu pomiędzy określonymi dwoma nukleotydami może powstać zredukowane wiązanie fosforynowe, a następnie, po utlenieniu, wiązanie fosfodiestrowe. Dzięki obecności grup ochronnych możliwe jest więc kontrolowanie sekwencji powstałego łańcucha nukleotydowego, ponieważ zapobiegają one losowemu tworzeniu wiązań pomiędzy nukleotydami.

Sztuczna synteza fragmentów DNA, które mogą kodować całe geny, stanowi użyteczne narzędzie w inżynierii biomedycznejinżynieria biomedycznainżynierii biomedycznej. Umożliwia badania naukowe, prowadzące m.in. do tworzenia szczepionek biotechnologicznych i do opracowywania nowych metod terapii genowej.

Słownik

inżynieria biomedyczna
inżynieria biomedyczna

dziedzina nauk technicznych zajmująca się opracowywaniem środków (metod, materiałów, aparatury, programów komputerowych itp.) do wspomagania badań w naukach biologicznych oraz do diagnostyki, terapii i rehabilitacji medycznej

ligaza DNA
ligaza DNA

enzym katalizujący wytwarzanie wiązania fosfodiestrowego między końcem 3′, a 5′ wolnych końców cząsteczek DNA

matryca
matryca

odcinek łańcucha polinukleotydowego, którego sekwencja jest podstawą do syntezy nowego, komplementarnego łańcucha

nukleotyd
nukleotyd

pochodna nukleozydu, w której grupa hydroksylowa (–OH) przy węglu piątym części cukrowej jest połączona wiązaniem estrowym (estry fosforanowe nukleozydów, fosforany nukleozydów) z cząsteczką kwasu fosforowego

nukleozyd
nukleozyd

związek organiczny zbudowany z zasady azotowej połączonej wiązaniem beta‑N-glikozydowym z pierwszym atomem węgla cukru pięciowęglowego

oligonukleotydy
oligonukleotydy

fragmenty kwasów nukleinowych o długości zwykle od kilkunastu do kilkudziesięciu nukleotydów

polimeraza DNA
polimeraza DNA

enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji; syntetyzuje nową nić polinukleotydową, komplementarną do nici macierzystej powielanej cząsteczki DNA

trifosforan nukleozydu
trifosforan nukleozydu

powstaje w wyniku estryfikacji reszty kwasu fosforowego w nukleotydzie następnymi cząsteczkami kwasu fosforowego

wiązanie fosfodiestrowe
wiązanie fosfodiestrowe

wiązanie chemiczne powstające w wyniku połączenia dwóch grup hydroksylowych przez grupę fosforanową