Wirtualne laboratorium (WL‑I)
Przeprowadź doświadczenie w wirtualnym laboratorium biotechnologicznym. Rozwiąż problem badawczy i zweryfikuj hipotezę. W formularzu zapisz swoje obserwacje, sformułuj wnioski i zweryfikuj hipotezy.
W celu produkcji białka X stworzono wstawkę z genem tego białka zakończoną lepkimi końcami. Przeprowadzono ligację wstawki z plazmidem (wektorem) w miejscu rozpoznawanym przez enzym HindIII. Ligacja może dawać trzy różne rezultaty:
brak wbudowania wstawki,
wstawka wbudowana w prawidłowej orientacji,
wstawka wbudowana w odwrotnej orientacji (nie ulega ekspresji).
Plazmidy namnożono w koloniach bakteryjnych, a następnie wyizolowano, otrzymując 5 próbek zawierających wyizolowane plazmidy (po jednej próbce z każdej kolonii bakteryjnej). W celu przeprowadzania analizy restrykcyjnej próbki trawiono enzymem PvuI. Na podstawie długości powstałych fragmentów można wnioskować o wyniku ligacji.
Problem badawczy: Które plazmidy po ligacji zawierają wstawki w odpowiedniej orientacji?
Hipoteza 1: Wszystkie plazmidy zawierają prawidłowo wbudowane wstawki.
Hipoteza 2: Wstawka została prawidłowo wbudowana tylko w niektóre plazmidy.
Materiał biologiczny:
plazmidy zawierające geny X uzyskane z kolonii bakteryjnych
Sprzęt laboratoryjny:
probówki Eppendorfa;
pipeta automatyczna z końcówkami;
aparat do elektroforezy;
kuweta z lodem.
Odczynniki:
woda destylowana;
bufor do trawienia z barwnikiem;
enzym restrykcyjny PuvI;
marker masy;
żel do elektroforezy.
Zasób interaktywny dostępny pod adresem https://zpe.gov.pl/a/DY2RHUaXD
Laboratorium 1
Przeprowadzono doświadczenie w wirtualnym laboratorium biotechnologicznym.
W celu produkcji białka X stworzono wstawkę z genem tego białka zakończoną lepkimi końcami i przeprowadzono ligację wstawki z plazmidem (wektorem) w miejscu rozpoznawanym przez enzym HindIII. Ligacja może dawać trzy różne rezultaty - są to brak wbudowania wstawki, wstawka wbudowana w prawidłowej orientacji (pod promotorem) oraz wstawka wbudowana w odwrotnej orientacji (nie ulega ekspresji). Plazmidy namnożono w koloniach bakteryjnych. W celu przeprowadzania analizy restrykcyjnej próbki trawiono enzymem PvuI. Na podstawie długości powstałych fragmentów można wnioskować o wyniku ligacji.
Problem badawczy: Czy plazmidy po ligacji zawierają wstawki w odpowiedniej orientacji?
Hipoteza 1: Wszystkie plazmidy zawierają prawidłowo wbudowane wstawki.
Hipoteza 2: Nie do wszystkich plazmidów udało się wbudować wstawkę w dobrej orientacji.
Materiał biologiczny: kolonie bakteryjne zawierające plazmidy po ligacji genu X.
Sprzęt laboratoryjny: probówki Eppendorfa, pipeta automatyczna z końcówkami, aparat do elektroforezy, kuweta z lodem.
Instrukcja wykonania doświadczenia:
Szczegóły doświadczenia 1
Bufor do trawienia zawiera jony magnezu, które są kofaktorami enzymów transkrypcyjnych.
Szczegóły doświadczenia 2
Bufor do trawienia zawiera również barwnik, dzięki któremu próbki rozdzielone na żelu są widoczne w świetle UV.
Szczegóły doświadczenia 3
W elektroforezie rozdział cząsteczek zachodzi zależnie od ich wielkości: mniejsze cząsteczki migrują szybciej niż duże. Marker masy zawiera fragmenty DNA o znanych długościach, dzięki czemu porównując układ prążków z próbek oraz z markera można oszacować długość fragmentów obecnych w próbkach.
Obserwacje: Odczytaj długość uzyskanych fragmentów w każdej próbce, porównując ich położenie z markerem masy.
Wnioski: Porównaj długość uzyskanych fragmentów z długością wzorcowych fragmentów zamieszczonych na schemacie powyżej.
Obserwacje: W kolejnych próbkach długość fragmentów uzyskanych w wyniku analizy restrykcyjnej wynosi kolejno:
1. 900 pz, 1000 pz, 2000 pz;
2. 500 pz, 900 pz i 2500 pz;
3. 900 pz, 1800 pz; 4. 500 pz, 900 pz i 2500 pz;
5. 500 pz, 900 pz i 2500 pz.
Wnioski: Wstawka wbudowała się prawidłowo w próbkach 2, 4 i 5, a w odwrotnej orientacji w próbce 1. W próbce 3 ligacja nie zaszła.
Weryfikacja hipotez: Hipoteza 1 jest nieprawdziwa, a hipoteza 2 jest prawdziwa.