Inne zastosowania biotechnologii molekularnej

Biologia molekularna znajduje szerokie zastosowanie w kryminalistyce i sądownictwie. Kryminalistyka zaczęła korzystać z osiągnięć genetyki w latach 80. XX w. Ustalenie profilu genetycznego daje szansę na wytypowanie sprawcy danego przestępstwa spośród osób podejrzanych. Profil genetyczny umożliwia również zidentyfikowanie ofiary.

Czym jest profil genetyczny?

Profil genetyczny tworzą specyficzne markery DNA, takie jak układy STR -krótkie powtórzenia tandemowe (ang. Short Tandem Repeat). Są to fragmenty genomu, głównie pozagenowego DNApozagenowe DNApozagenowego DNA, w których krótka sekwencja o długości od 1 do 6 nukleotydów powtarza się wielokrotnie jeden po drugim. 

Liczba powtórzeń sekwencji STR jest różna u różnych osób, dlatego profil genetyczny jest swoistym „genetycznym odciskiem palca”. Sytuacja, w której dwie osoby mają takie same profile genetyczne, dotyczy tylko bliźniąt jednojajowych. 

Porównywanie profili genetycznych pozwala na:

• określenie pokrewieństwa, dzięki czemu wykorzystuje się je podczas ustalania ojcostwa,

• identyfikację osobniczą, na przykład osób zaginionych, sprawców przestępstw czy ofiar. 

Ustalanie profilu genetycznego

Profil genetyczny ustalany jest według ściśle określonej procedury, która obejmuje: 

1. izolację materiału genetycznego osoby, której profil ma zostać ustalony; 

2. namnożenie materiału genetycznego w reakcji PCR, przy czym namnaża się wybrane sekwencje STR (minimum 15)  z zastosowaniem starterów komplementarnych do początku i końca każdej z nich;  

3. przeprowadzenie elektroforezy, umożliwiającej rozdział powstałych fragmentów DNA według ich długości; 

4. porównanie uzyskanego wzoru prążków DNA ze wzorcem (np. uzyskanym od podejrzanego lub domniemanego ojca); 

5. analizę statystyczną otrzymanych wyników, która pozwala to na określenie stopnia prawdopodobieństwa wystąpienia przypadkowej zgodności profili genetycznych różnych osób.

Gdy w pobranej próbce jest zbyt mało DNA jądrowego lub gdy jest on mocno zniszczony lub zanieczyszczony, bierze się pod uwagę DNA mitochondrialny – mtDNA, który występuje w komórkach w większej liczbie kopii niż jądrowy.

RlvS7b34LgyLS

Ilustracja ukazuje fragmenty DNA o różnej długości rozdzielone na żelu agarozowym. W niektórych miejscach są poziome prążki. Świecą na kolor różowy.

RtmEZQLmZruQo

Grafika przedstawia przykładowy profil genetyczny. Jest to wykres. Na osi poziomej znajdują się długości odcinków (w nukleotydach). Zaznaczono wartości 0, 100, 200, 300 i tak dalej, aż do 1000. Na osi pionowej umieszczono natężenie fluorescencji. Wartości wzrastają o 50, zaczynając od 0, a kończąc na 300. Na wykresie zaznaczono trójkątne piki.

Ustalenie profilu genetycznego ofiary lub przestępcy

Aby możliwe było ustalenie profilu genetycznego, konieczne jest znalezienie na miejscu zbrodni śladu biologicznego. Może nim być, np.:

• włos,

• resztki tkanki spod paznokci ofiary,

• krew,

• pot,

• wydzieliny z nosa,

• ślina,

• nasienie.

Niezwykle ważne jest odpowiednie zabezpieczenie materiału dowodowego i niedopuszczenie do jego zanieczyszczenia (w przeciwnym wypadku wynik analizy będzie fałszywy). 

Przykład 1

Na miejscu zbrodni pobrano materiał biologiczny ze śladów krwi niezidentyfikowanych osób. Następnie pobrano krew od ofiary przestępstwa (kobiety) i 2 podejrzewanych mężczyzn. W jednej z próbek krwi pochodzącej z miejsca zbrodni i próbce pobranej od poszkodowanej kobiety prążki DNA są na tej samej wysokości, zatem pierwsza z badanych próbek krwi pochodzi od ofiary. Cechy DNA podejrzanego B są zgodne z drugą próbką krwi pobraną na miejscu przestępstwa.

RKFutegcen9WX

Schemat identyfikacji gwałciciela na podstawie danych genetycznych. Grafika przedstawia porównanie próbek DNA poddanych elektroforezie. Widoczne jest sześć kolumn, w których na różnych wysokościach rozmieszczone są fioletowe prązki. Pierwsza kolumna to DNA pobrane z próbki krwi ofiary, druga – z próbki krwi podejrzanego A, trzecia – z próbki krwi podejrzanego B. W czwartej kolumnie znajduje się marker DNA, zaznaczono w niej wszystkie możliwe do uzyskania prążki. W kolumnach piątej i szóstej umieszczono DNA pobrane na miejscu zbrodni, w piątej kolumnie frakcję żeńską, a w szóstej frakcję męską. Rozłożenie prążków jest takie same w kolumnie trzeciej (próbka krwi podejrzanego B) oraz w kolumnie szóstej (frakcja męska DNA pobranego na miejscu zbrodni), przez co, cechy DNA podejrzanego B są zgodne z drugą próbką krwi pobraną na miejscu przestępstwa.

Ćwiczenie 1

Na podstawie wyniku elektroforezy określ, który z podejrzanych P1‑P4 popełnił przestępstwo. Uzasadnij odpowiedź.

R8SHSXP6RNLHE

Ilustracja przedstawia wyniki elektroforezy przestępcy oraz czterech podejrzanych (P1 - P4). Na ilustracji w prostokątnej ramce ponowo znajduje się układ poziomych linii. Są one pod napisami: DNA znalezione na ciele ofiary, P1. P2, P3, P4. Poziome linie to unikatowe wzory prążkowe. Układ prążków pod P3 jest identyczny z tym pod nazwą Przestępca.

R1VRSU88FCREO

Podpowiedź

Podpowiedź

Porównaj profile genetyczne poszczególnych podejrzanych z profilem genetycznym przestępcy.

Odpowiedź

Odpowiedź

Profil genetyczny podejrzanego oznaczonego numerem 3 pokrywa się z profilem genetycznym przestępcy. Na tej podstawie można stwierdzić, że materiał genetyczny tej osoby znajdował się na miejscu przestępstwa.

Badanie ojcostwa

Profile genetyczne ustala się powszechnie w sprawach o ustalanie lub wykluczanie ojcostwa.

Badanie ojcostwa polega na porównaniu profilu genetycznego dziecka z profilem genetycznym matki i domniemanego ojca. W tym celu pobiera się materiał biologiczny (najczęściej w postaci wymazu z wewnętrznej strony policzka) od dziecka, matki i domniemanego ojca. Wykonuje się dwa niezależne testy.

Poniżej przedstawiono uproszczony wynik testu na ojcostwo. Liczba powtórzeń danego motywu STR (sekwencji STR) w konkretnym miejscu na chromosomie nazywana jest „allelem”.

R1JSE8JQR3M7O

W tabeli zamieszczono uproszczony wynik w badaniu ojcostwa. W tabeli są następujące kolumny: sekwencja STR, Matka, Domniemany ojciec, Dziecko. Sekwencja STR 1. Matka allel 1 - 12, allel 2 - 15, Domniemany ojciec - allel 1 - 11, allel 2 - 14, Dziecko allel 1 -12, allel 2 - 14. Sekwencja STR 2. Matka allel 1 - 27, allel 2 - 31, domniemamy ojciec allel 1 - 25, allel 2 - 30, dziecko allel 1 - 25, allel 2 - 31. Sekwencja STR 3. Matka allel 1 - 23, allel 2 - 21, domniemany ojciec allel 1 - 26, allel 2 - 22, dziecko allel 1 - 23, allel 2 - 22. Sekwencja STR 4. Matka allel 1 - 10, allel 2 - 9, domniemany ojciec allel 1 - 9, allel 2 8, dziecko allel 1 - 9, allel 2 - 9.

W profilu genetycznym dziecka znajdują się sekwencje DNA obecne w profilu genetycznym domniemanego ojca. Oznacza to, że mężczyzna jest ojcem tego dziecka. Gdyby dziecko nie było potomkiem tego mężczyzny, w jego profilu genetycznym występowałyby allele, których nie można byłoby przypisać domniemanemu ojcu.

1

Ćwiczenie 2

Animacja poniżej pokazuje wyniki badań genetycznych w rodzinie Anny i Marka. Zapoznaj się z nią, odpowiedz na pytanie postawione na końcu filmu, a odpowiedź uzasadnij.

R1dERVyS6JHFN

Film przedstawia profile genetyczne rodziny Anny i Marka.

Film przedstawia profile genetyczne rodziny Anny i Marka.

Film dostępny pod adresem /preview/resource/R1dERVyS6JHFN

Film przedstawia profile genetyczne rodziny Anny i Marka.

REoAOXxXMnIUc

(Uzupełnij).

Wskazówki i klucze odpowiedzi

Pokaż podpowiedź

Zwróć uwagę, że osoby blisko spokrewnione – rodzeństwo, matka i dzieci będą mieć część prążków w tych samych miejscach.

Pokaż odpowiedź

Tymek nie jest dzieckiem młodszej siostry Anny, ponieważ jego profil genetyczny nie jest w żadnym stopniu podobny do profilu – żaden z prążków się nie pokrywa. Gdyby Tymek był dzieckiem siostry Anny, miałby część prążków takich samych jak Anna, ponieważ Anna i jej siostra powinny mieć część prążków takich samych.

Identyfikacja osób zaginionych i o nieznanej tożsamości

Badania DNA prowadzone są rutynowo w sytuacji odnalezienia osoby o nieznanej tożsamości oraz szczątków ludzkich. Podejmuje się je zwłaszcza wtedy, gdy nie można pobrać odcisków palców lub nie ma odcisków palców tej osoby w bazach danych. W przypadku osób zaginionych pozyskuje od ich rodzin materiał biologiczny znajdujący się na przykład na grzebieniu z włosami albo na chusteczce higienicznej, a w przypadku identyfikacji osób o nieznanej tożsamości, np. ofiar katastrof materiał pobiera się z odnalezionych szczątków. 

R1A9ye4dBCfqu

Zdjęcie przedstawia kości ludzkie w masowym grobie. Znajduje się w nim kilkadziesiąt szczątków. Ma on kształt prostokąta. Ziemia wokół jest jasnobrązowa.

Ustalanie pokrewieństwa w badaniach nad bioróżnorodnością i ewolucją

Ustalanie pokrewieństwa między organizmami opiera się na analizie porównawczej sekwencji genomów organizmów. W toku ewolucji w DNA organizmów pojawiają się mutacje, ale w jednych jego fragmentach występują częściej, a w innych rzadziej. Sekwencje, w których rzadko dochodzi do mutacji, nazywane sekwencjami konserwatywnymi, są najczęściej do tego rodzaju porównań. Często badane są również same sekwencje aminokwasowe białek. Wynika to z faktu, że nie każda zmiana w genie (mutacja) skutkuje zmianą aminokwasu, dzięki czemu białka zachowują wysoki stopień podobieństwa nawet wtedy, gdy w samym kodzie genetycznym zaszły już pewne modyfikacje.

Wyniki analizy porównawczej pozwalają określić stopień podobieństwa sekwencji, co stanowi podstawę do konstruowania drzew filogenetycznychdrzewo filogenetycznedrzew filogenetycznych. Przyjmuje się, że im wyższy stopień homologiihomologiahomologii badanych fragmentów, tym bliżej spokrewnione ze sobą są dane organizmy. Aby precyzyjnie ustalić relacje ewolucyjne, konieczne jest porównanie wielu różnych markerów lub całych genomów; opieranie się na pojedynczych, krótkich fragmentach DNA może prowadzić do błędnych wniosków.

Konstruowanie drzew filogenetycznych

Do tworzenia drzew filogenetycznych wykorzystywane są programy komputerowe oraz narzędzia dostępne bezpośrednio w bazach danych, gromadzących informacje o sekwencjach DNA. Jedną z najczęściej używanych baz danych jest NCBI (ang. National Center for Biotechnology Information). Na stronie internetowej NCBI znajduje się specjalna zakładka poświęcona taksonomii oraz ustalaniu homologii między sekwencjami DNA lub białek. Do analizy można użyć danych zawartych w bazie, jak również własnych wyników. Drzewa filogenetyczne wykonane w różnych programach mogą się jednak różnić, ze względu na różne modele matematyczne wykorzystywane do analiz. 

Do analizy pokrewieństwa często wykorzystywany jest rRNA - rybosomalny RNA. Szczególnie często stosowany jest fragment 16S podjednostki rybosomalnej, który jest wysoce konserwatywny. Przykładem innej porównywanej sekwencji konserwatywnej jest mitochondrialny gen kodujący cytochrom ccytochrom ccytochrom c, który mają rośliny, zwierzęta i wiele mikroorganizmów. U gatunków blisko spokrewnionych, takich jak ludzie i szympansy, sekwencja ta jest niemal identyczna, natomiast u dalszych krewnych różni się ona proporcjonalnie do czasu, jaki upłynął od rozdzielenia ich linii ewolucyjnych. Dzięki temu obecność tego genu w materiale genetycznym pozwala z wysokim prawdopodobieństwem ustalić pozycję taksonomiczną badanego organizmu.

Początków drzewa filogenetycznego upatruje się w hipotetycznym organizmie nazwanym last universal common ancestor (LUCA), czyli ostatnim uniwersalnym wspólnym przodkiem. Nie był to pierwszy żywy organizm na Ziemi, ale ostatni, od którego wywodzą się wszystkie współczesne linie ewolucyjne. Jeśli wyobrazimy sobie pierwsze organizmy jako pień drzewa życia, LUCA będzie ostatnim z nich przed pierwszym rozgałęzieniem pnia. Zdaniem naukowców był to jednokomórkowiec prawdopodobnie podobny do dzisiejszych archeonów.

R1MC2lK3I8Xaw

Grafika przedstawia drzewo filogenetyczne, w którym od pierwszego wspólnego przodka (Luca) odchodzą trzy gałęzie: bakterie, archeony i eukarionty. Gałąź od dołu w bakteriach ma następujące nazwy: Aquifex, Termotonga, Chloroflexi, Bacteroides Cytophaga, Gram‑dodatnie, Planctomyces, sinice, proteobakterie, krętki. Gałąź archeonów od dołu: Pyrodicticum, Thermoproteus, Thermococcus celer, Methanococcus, Methanobacterium, Methanosarcina, halobakterie. Gałąź eukariontów od dołu: lambliowate, mukrosporydia, rzęsistki, wiciowce, orzęski, pełzaki, śluzowce, rośliny, zwierzęta, grzyby.

Szanse i zagrożenia biotechnologii molekularnej

Perspektywy rozwoju biotechnologii molekularnej są bardzo szerokie. Przewiduje się, że w przyszłości posłuży ona do:

• rozwoju terapii genowych polegających na wszczepianiu do komórek obcych kwasów nukleinowych,

• terapii chorób, które obecnie określa się jako choroby nieuleczalne,

• tworzenia bardziej skutecznych i mniej szkodliwych biofarmaceutyków,

• wykorzystania hodowli komórek macierzystych w leczeniu chorób serca, udaru mózgu czy stwardnienia rozsianego, a nawet do produkcji narządów wszczepianych chorym,

• wytwarzania na szeroką skalę biomateriałów (biodegradowalnych tworzyw) oraz biopaliw z odnawialnych surowców (takich jak etanol, biodiesel, biogaz czy też sama biomasa),

• zmniejszenia problemu głodu na świecie poprzez zwiększenie ilości i jakości plonów.

Biotechnologii molekularna niesie ze sobą także zagrożenia w różnych dziedzinach życia. 

Możliwe zagrożenia zdrowotne i etyczne to m.in. 

• możliwość nieprzewidzianych skutków ubocznych terapii, w których wykorzystywano inżynierię genetyczną,

• długoterminowe skutki stosowania produktów biotechnologicznych, które mogą ujawniać się dopiero po wielu latach,

• ingerencja w genom człowieka, szczególnie w kontekście modyfikacji zarodków,

• niszczenie zarodków ludzkich w badaniach naukowych i terapiach eksperymentalnych.

Obawy o negatywny wpływ na środowisko i rolnictwo:

• przenoszenie zmodyfikowanych genów do populacji dzikich organizmów,

• spadek bioróżnorodności w wyniku rozpowszechnienia organizmów o dużej przewadze konkurencyjnej,

• uzależnienie rolnictwa od jednego typu odmian genetycznie zmodyfikowanych,

• wzrost odporności szkodników i patogenów na środki ochrony roślin,

Zagrożenia społeczne, ekonomiczne oraz związane z bezpieczeństwem:

• nierówny dostęp do nowoczesnych terapii i technologii biotechnologicznych,

• komercjalizacja życia i podporządkowanie badań naukowych interesom ekonomicznym,

• możliwość wykorzystania wiedzy biotechnologicznej do tworzenia broni biologicznej,

• niewystarczające regulacje prawne lub ich omijanie w niektórych krajach.

Podsumowanie

• Profil genetyczny opiera się na analizie markerów DNA (głównie STR) i jest unikalny dla każdego człowieka, z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych.

• Analiza profilu genetycznego znajduje zastosowanie w medycynie sądowej i kryminalistyce, m.in. w identyfikacji sprawców przestępstw, ofiar, osób zaginionych oraz szczątków ludzkich.

• Ustalanie profilu DNA wymaga zabezpieczenia materiału biologicznego, izolacji DNA, jego namnożenia metodą PCR oraz rozdziału fragmentów DNA za pomocą elektroforezy.

• Wyniki badań DNA są interpretowane z wykorzystaniem obliczeń statystycznych, co pozwala ocenić prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności profili.

• Profile genetyczne wykorzystywane są w badaniach pokrewieństwa, w tym w sprawach o ustalenie lub wykluczenie ojcostwa.

• Analiza sekwencji DNA i białek umożliwia ustalanie stopnia pokrewieństwa między organizmami oraz konstruowanie drzew filogenetycznych.

• Biotechnologia molekularna stwarza szanse rozwoju terapii genowych, nowoczesnych leków, diagnostyki oraz zastosowań w ochronie zdrowia i środowiska.

• Rozwój biotechnologii wiąże się również z zagrożeniami zdrowotnymi, środowiskowymi, społecznymi i etycznymi, m.in. ingerencją w genom człowieka czy spadkiem bioróżnorodności.

Ćwiczenia utrwalające