Zastosowania biotechnologii molekularnej w medycynie

Współczesna biologia i medycyna w coraz większym stopniu opierają się na osiągnięciach genetyki i inżynierii genetycznej, które umożliwiają analizę, modyfikację oraz świadome wykorzystanie materiału genetycznego człowieka. Dynamiczny rozwój terapii genowej oraz diagnostyki molekularnej stał się możliwy dzięki poznaniu struktury i sekwencji DNA człowieka, czego przełomowym etapem był Projekt Sekwencjonowania Genomu Ludzkiego. Uzyskana wiedza stanowi podstawę nowoczesnych metod wykrywania chorób genetycznych, doboru terapii oraz dalszego rozwoju medycyny opartej na analizie genomu. Istotnym elementem opieki zdrowotnej pozostaje poradnictwo genetyczne, pozwalające na ocenę ryzyka wystąpienia chorób dziedzicznych i podejmowanie odpowiedzialnych decyzji diagnostycznych i terapeutycznych.

Human Genome Project (HGP) – Projekt poznania genomu ludzkiego

W 1988 r. założono międzynarodową organizację Human Genome Organisation (HUGO), koordynującą współpracę wielu jednostek naukowych zajmujących się genomikągenomikagenomiką. Efektem prac naukowców było zapoczątkowanie Human Genome Project (HGP) – programu naukowego, który miał na celu poznanie sekwencji DNA ludzkiego genomu i identyfikację występujących w nim genów. 

Dawcami DNA do projektu były anonimowe osoby pochodzące z Europy, Afryki, Azji oraz Ameryki Północnej, Środkowej i Południowej. W 2000 r. ogłoszono, że poznano wstępny opis genomu człowieka, a dane opublikowano w dwóch niezależnych artykułach w czasopismach „Science” oraz „Nature”. Dane pochodzące z HGP są publicznie dostępne. 

RK2huOzAuou8B1

Ilustracja przedstawia logo programu Human Genome Project, na którym widoczna jest sylwetka człowieka opleciona przez podwójną helisę DNA. Wokół niej widnieją napisy w języku angielskim, nazw dziedzin nauki: chemia, biologia, fizyka, etyka, inżynieria, informatyka.

Poznanie genomu człowieka pozwoliło na oszacowanie liczby występujących w nim genów na ok. 22,3 tys. (początkowo zakładano istnienie ok. 100 tys. genów). Nadal są prowadzone badania nad identyfikacją i funkcją genów, a także publikowane analizy sekwencji poszczególnych chromosomów. 

Dodatkowym efektem pracy przy poznaniu sekwencji genomu ludzkiego było także poznanie sekwencji genów innych organizmów, w tym E. coli czy myszy. Dane te pozwoliły na analizę porównawczą i wyznaczenie stopnia podobieństwa między organizmami. Analiza genomu człowieka przyczyniła się także do rozwoju technik biologii molekularnej oraz wywołała dyskusję na temat zagrożeń związanych z ingerencją w jego strukturę.

RXT5EcIOcjOrQ

Zdjęcie przedstawia regał, który wypełniony jest ponumerowanymi segregatorami. Mają ona kolor biały. Ściana za regałem jest czerwona, z lewej strony widnieje kabina zbudowana z szyb w białej ramie, wewnątrz której znajduje się jakaś maszyna.

Dodatkowym efektem pracy przy poznaniu sekwencji genomu ludzkiego było także poznanie sekwencji genów innych organizmów, w tym E. coli czy myszy. Dane te pozwoliły na analizę porównawczą i wyznaczenie stopnia podobieństwa między organizmami. Analiza genomu człowieka przyczyniła się także do rozwoju technik biologii molekularnej oraz wywołała dyskusję na temat zagrożeń związanych z ingerencją w jego strukturę. 

Diagnostyka molekularna chorób genetycznych

W wyniku rozwoju technik biologii molekularnej powstała nowa gałąź medycyny – diagnostyka molekularna. Umożliwia ona analizę fragmentów kwasów nukleinowych w celu wykrycia genotypu związanego ze schorzeniami uwarunkowanymi genetycznie. Badania molekularne stają się coraz bardziej powszechne: wykrywają nie tylko choroby genetyczne, ale i mutacje, które zwiększają ryzyko ich wystąpienia. Są to metody bardzo czułe i specyficzne.

Najczęściej stosowane techniki stosowane w diagnostyce molekularnej to: sekwencjonowanie DNA, PCR, analiza restrykcyjna i hybrydyzacja kwasów nukleinowych.

Badanie z zakresu diagnostyki molekularnej polega na pobraniu materiału genetycznego pacjenta, a następnie jego weryfikacji pod kątem obecności obcych genów (w przypadku niektórych chorób zakaźnych) albo mutacji. Materiał ten to najczęściej krew (leukocyty), komórki nabłonka (z wymazu z jamy ustnej) oraz włosy (cebulka włosowa). Trzeba jednak pamiętać, że substancje z informacją  genetyczną znajdują się w każdej żywej komórce, dlatego do badań tego rodzaju można wykorzystać dowolny rodzaj tkanki.

Badania molekularne ze względu na cel prowadzenia można podzielić na: 

• testy diagnostyczne -pozwalają na identyfikację chorób genetycznych w celu dobrania potencjalnych metod łagodzenia objawów;

• testy prognostyczne - pozwalają oszacować ryzyko zachorowania, dzięki czemu można wdrożyć odpowiednie działania profilaktyczne;

• badania na nosicielstwo - umożliwiają określenie prawdopodobieństwa wystąpienia chorób genetycznych u potomstwa.

Poradnictwo genetyczne

Poradnictwo genetyczne polega na oszacowaniu prawdopodobieństwa pojawienia się choroby u osób obciążonych rodzinnie lub u potomstwa takich osób. 

Zadania poradni genetycznej to m.in. przeprowadzenie wywiadu rodzinnego, określenie ryzyka wystąpienia choroby oraz wykonanie testów genetycznej predyspozycji do określonych chorób. Z poradnictwa genetycznego mogą również skorzystać pary starające się o dziecko, szczególnie jeśli w ich rodzinach występowały choroby genetyczne lub wiek kobiety przekracza 35 lat. Głównymi zadaniami specjalistów z poradni są:

• ustalenie, czy u dziecka, które ma się urodzić, może wystąpić choroba dziedziczna;

• określenie szans na urodzenie zdrowego potomka w przypadku, gdy rodzice mają już jedno chore dziecko – oszacowanie ryzyka wystąpienia choroby genetycznej u kolejnych dzieci;

• diagnostyka pod kątem choroby genetycznej u dziecka wykazującego zaburzenia w funkcjonowaniu organizmu lub nieprawidłową budowę ciała;

• sformułowanie zaleceń dotyczących profilaktyki zdrowotnej dla matki i mającego się urodzić dziecka lub dziecka chorego, a w szczególności wskazanie czynników ryzyka i sposobów minimalizowania ich wpływu na organizm;

• udzielenie wsparcia psychologicznego osobom z chorobą genetyczną i ich rodzinom.

R1NG86E9FSEvs

Na zdjęciu zobrazowany jest przegląd wyników badań chromosomów. Na niebieskiej tablicy widoczne jest 21 par chromosomów w postaci równoległych, nieregularnych linii zbliżonych kształtem do litery X. Pod numerem 15 widać trzy równoległe do siebie linie. W dolnym rogu znajduje się ludzka dłoń ze czarnym, cienkim, zaostrzonym na końcu wskaźnikiem, który dotyka tablicy.

Możliwość skorzystania z porad jest szczególnie przydatna dla kobiet planujących ciążę po 35. roku życia. Wtedy ryzyko urodzenia dziecka z wadą genetyczną znacząco wzrasta, podczas gdy w przypadku kobiet młodszych wynosi ok. 3–4%.

Terapia genowa

Terapia genowa  polega na wprowadzeniu obcego kwasu nukleinowego do komórek chorego pacjenta w celach terapeutycznych.

Celem terapii genowej jest naprawienie bezpośredniej przyczyny choroby genetycznej poprzez:

• wprowadzenie nowego genu do organizmu, aby wspomóc go w walce z chorobą;

• wprowadzenie do komórek prawidłowej kopii genu, którego defekt wywołuje chorobę;

• dezaktywację genu, który działa nieprawidłowo;

• spowodowanie, że komórka przejdzie na drogę apoptozy (programowanej śmierci).

Terapii genowej nie prowadzi się w odniesieniu do wszystkich komórek ciała, a jedynie tych tkanek, w których zachodzi ekspresja danego genu i których wadliwe działanie związane jest z wywołaniem stanu chorobowego.

Istotnym aspektem prawidłowo przeprowadzonej terapii genowej jest zdolność do namnażania się komórek, do których wprowadzono prawidłową wersję genu. Jeżeli komórki te nie mają takiej zdolności lub jest ona utrzymana tylko przez określony czas, to niestety efekt terapii nie jest trwały. Prawidłowa wersja genu musi zostać utrzymana w organizmie i przekazana komórkom potomnym.

Za pomocą terapii genowej można leczyć takie choroby jednogenowe, jak:

• mukowiscydoza;

• ciężki złożony niedobór odporności (zespół SCID);

• choroba Huntingtona;

• wrodzona ślepota Lebera;

• rodzinna hipercholesterolemia;

• rdzeniowy zanik mięśni u dzieci.

Metody terapii genowej

Terapię genową można przeprowadzać na dwa sposoby:

• ex vivo – sposób polegający na pobraniu komórek od pacjenta, wprowadzeniu do nich terapeutycznego kwasu nukleinowego i podaniu ich ponownie pacjentowi;

• in vivo – sposób polegający na wprowadzeniu nośnika kwasu nukleinowego bezpośrednio do organizmu pacjenta.

Ex vivo

Terapia ta polega na pobraniu od pacjenta komórek somatycznych, najczęściej macierzystychkomórki macierzystemacierzystych (np. szpiku kostnego), czyli na izolacji komórek, oraz na wprowadzeniu do nich prawidłowego allelu w warunkach laboratoryjnych. Nowa wersja genu zastępuje gen nieprawidłowy. Tak zmodyfikowane komórki są następnie wprowadzane do miejsca docelowego w ciele chorego. Procedura ta jest szczególnie skuteczna w przypadku modyfikacji komórek szpiku czy krwi.

In vivo

Terapia ta polega na wprowadzeniu fragmentu DNA zawierającego prawidłową wersję genu bezpośrednio do docelowych komórek w ciele pacjenta. W tym celu wykorzystywane są specjalne wektory genetyczne, które dostarczają gen do komórek. Jako wektory mogą być stosowane zmodyfikowane wirusy lub liposomy, czyli struktury otoczone dwuwarstwą lipidową, do których wprowadza się prawidłowy allel.

Dla zainteresowanych

Obecnie zadaniem terapii genowych jest leczenie pewnych wybranych uszkodzeń konkretnych genów. Ich działanie jest więc zawężone do małej grupy potencjalnych pacjentów, a przy tym bardzo kosztowne. Od niedawna istnieje możliwość leczenia wrodzonej ślepoty Lebera metodą terapii genowej u pacjentów z mutacjami w genie RPE65. Lek zarejestrowano w 2017 roku pod nazwą handlową Luxturna. Celem terapii genowej jest przywrócenie działania fotoreceptorów i zahamowanie ich utraty. Do siatkówki oka pacjenta za pośrednictwem rekombinowanego wektora (np. wirusowego) wprowadzany jest funkcjonalny gen RPE65. Prowadzone są również próby kliniczne w celu opracowania podobnej terapii w odniesieniu do innych genów. Ustalenie podłoża molekularnego choroby, czyli identyfikacja mutacji powodujących chorobę, może dać szansę na skuteczne leczenie pacjentów z wrodzoną ślepotą Lebera.

RHOW3uXbStSWP1

SSchemat ilustruje somatyczną terapię genową mającą na celu wyleczenie wrodzonej ślepoty. Na pierwszej ilustracji znajduje się chromosom ludzki w kształcie szarej litery X. Na jego prawym dolnym ramieniu widnieje niewielki, czerwony wycinek z podpisem: skopiowanie prawidłowego genu RPE65. Pod tą ilustracją znajduje się adenowirus zawierający DNA zobrazowany jako pomarańczowe koło, na obwodzie którego umieszczono niewielkie, brązowe kółka. Wewnątrz koła umieszczony jest jasnopomarańczowy sześciokąt, w którym znajduje się szeroka, szara linia w kształcie litery S. Od obu tych obrazków prowadzą strzałki do grafiki podpisanej jako: wprowadzenie genu RPE65 do DNA wirusa. Zilustrowany jest jako pomarańczowe koło, na obwodzie którego umieszczono niewielkie, brązowe kółka. Wewnątrz koła umieszczony jest jasnopomarańczowy sześciokąt, w którym znajduje się szeroka, szara linia w kształcie litery S. Fragment tej linii ma kolor czerwony. Od niego prowadzi strzałka do schematycznie przedstawionej gałki ocznej w postaci koła z soczewką w przedniej części, w którą wbita jest igła strzykawki wypełnionej czerwonym płynem. Pod spodem znajduje się podpis: wszczepienie zmodyfikowanych wirusów do komórek siatkówki. Kolejna strzałka prowadzi do ilustracji z wirusem zilustrowanym jako pomarańczowe koło, na obwodzie którego umieszczono niewielkie, brązowe kółka. Wewnątrz koła umieszczony jest jasnopomarańczowy sześciokąt, w którym znajduje się szeroka, szara linia w kształcie litery S. Fragment tej linii ma kolor czerwony. Wirus ten łączy się z komórką w kształcie półkola. Wewnątrz niej znajduje się chromosom ludzki w kształcie szarej litery X. Na jego prawym dolnym ramieniu znajduje się niewielki, niebieski wycinek z podpisem: uszkodzony gen RPE65. Następna strzałka prowadzi do ludzkiego chromosomu w kształcie szarej litery X. Na jego prawym dolnym ramieniu znajduje się niewielki, czerwony wycinek. Pod rysunkiem widnieje napis: zastąpienie uszkodzonego genu przez prawidłowy gen.

Zagrożenia i szanse terapii genowej

Pomimo sukcesów terapia genowa wciąż niesie ze sobą pewne ryzyko. Materiał genetyczny wirusów wykorzystywanych w terapii łatwo ulega mutacjom, dlatego zmodyfikowany wirus może się stać niebezpieczny. Wprowadzone wirusy mogą także wywołać niepożądaną reakcję układu odpornościowego i w efekcie spowodować stan zapalny, a nawet niewydolność narządów. Ponadto w terapii tej nie jest możliwa kontrola miejsca wbudowania materiału genetycznego, co może skutkować zmianą innych istotnych funkcji komórki. Ograniczeniami terapii genowej są także jej wysokie koszty i niestety niska efektywność kliniczna – ocenia się, że tylko 1 na 10 podjętych prób leczenia przynosi rzeczywiste efekty terapeutyczne.

Istnieją realne szanse, że terapia genowa będzie wykorzystywana w leczeniu pacjentów nowotworowych. W tym wypadku nie jest konieczna długa ekspresja genu w komórkach, a główna wada większości wektorów – odpowiedź immunologiczna organizmu w stosunku do komórek nowotworowych – jest cechą oczekiwaną.

W dalszym ciągu dużym wyzwaniem pozostaje leczenie chorób genetycznych. Wymagają one wysokiego bezpieczeństwa stosowanych preparatów oraz długotrwałej ekspresji DNA terapeutycznego. W tym przypadku obiecujące jest wykorzystanie wektorów, które umożliwiają wprowadzenie genu w ściśle określone miejsce w genomie pacjenta.

Komórki macierzyste

R1FjdzdBTDlPw1

Zdjęcie spod mikroskopu fluorescencyjnego przedstawia owalny kształt z grubą otoczką, która składa się z czerwonych, niebieskich oraz zielonych plam. Środkowa część kształtu jest ciemna z rzadszymi niebieskimi plamami.

Komórki macierzyste to niezróżnicowane i niewyspecjalizowane komórki występujące naturalnie w organizmie (komórki macierzyste tkanek) zwierząt i człowieka, a także wyhodowane w warunkach in vitro, zdolne do nieograniczonych podziałów (proliferacji) przez całe życie organizmu. 

Każda komórka macierzysta, dzieląc się, wytwarza dwie komórki potomne, z których jedna pozostaje komórką macierzystą, a druga jest komórką prekursorową. Komórka prekursorowa od razu różnicuje się w wyspecjalizowaną komórkę tkanki lub dzieli się wielokrotnie, w wyniku czego powstają komórki, które następnie ulegają różnicowaniu. 

Komórki macierzyste mają potencjał przekształcenia się w inne typy komórek organizmu w zależności od czynników środowiskowych. Istotną ich cechą jest zdolność do namnażania się i różnicowania z zachowaniem stałej liczby komórek macierzystych w organizmie. Jest to niezmiernie ważne ze względu na zachodzące w tkankach procesy odnowy i regeneracji.

Dzięki zdolności do samoodnowy i różnicowania komórki macierzyste stanowią podstawę medycyny regeneracyjnej oraz terapii komórkowych, umożliwiając odbudowę uszkodzonych tkanek i leczenie wielu chorób, w tym chorób degeneracyjnych.

Wyróżnia się kilka głównych rodzajów komórek macierzystych:

Komórki macierzyste totipotencjalnewystępują na najwcześniejszych etapach rozwoju zarodkowego. Są to zygota oraz pierwsze blastomeryblastomeryblastomery powstające w wyniku bruzdkowaniabruzdkowaniebruzdkowania. Komórki te mają zdolność do nieograniczonego podziału oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu, włącznie z komórkami tkanek pozazarodkowych (np. łożyska). Oznacza to, że pojedyncza komórka totipotencjalna może dać początek całemu organizmowi.

Komórki macierzyste pluripotencjalne (embrionalne) występują w stadium blastocystyblastocystablastocysty, w obrębie węzła zarodkowego (wewnętrznej masy komórkowej). Są zdolne do przekształcania się w komórki i tkanki wywodzące się z trzech listków zarodkowychlistki zarodkowelistków zarodkowych (ektodermy, mezodermy i endodermy), jednak nie różnicują się w komórki tkanek pozazarodkowych, takich jak łożysko.Z tego względu nie mogą samodzielnie utworzyć całego organizmu.

Komórki macierzyste multipotencjalne mogą przekształcać się w komórki wywodzące się tylko z tego listka zarodkowego, z którego pochodzą. Do tej grupy zalicza się m.in. krwiotwórcze komórki macierzyste, których źródłem jest szpik kostny i krew pępowinowa.

Komórki macierzyste unipotencjalne to dojrzałe komórki macierzyste występujące w tkankach organizmu. Zwane są często komórkami macierzystymi somatycznymi i mogą różnicować się tylko w jeden rodzaj komórek, w zależności od warunków otoczenia i miejsca występowania w organizmie. Ich obecność w tkankach dorosłego człowieka zapewnia utrzymanie zdolności regeneracji organizmu i zastępowanie starych wyspecjalizowanych komórek ciała komórkami młodymi.

Dla zainteresowanych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Naukowcy wykazali, że często w hodowli in vitro komórka macierzysta jednej tkanki może różnicować się w komórki innej tkanki, w zależności od warunków prowadzonej hodowli. Obecnie badania naukowe skierowane są ku otrzymywaniu tzw. indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC, ang. induced pluripotent stem cells). Są one otrzymywane ze zmodyfikowanych genetycznie komórek somatycznych, w których pod wpływem czynników transkrypcyjnych zachodzą procesy odróżnicowaniaodróżnicowanieodróżnicowania komórki. Metodę tę po raz pierwszy zastosowano w 2006 r. w przypadku mysich fibroblastów. W 2012 r. za opracowanie metody przeprogramowania dorosłych komórek organizmu w komórki pluripotencjalne Shin’ya Yamanaka i John Gurdon otrzymali Nagrodę Nobla.

Komórki iPSC mogą być pozyskiwane z własnych komórek jądrzastych pacjenta. Wykorzystywane są do przeszczepu i zastępowania wadliwych komórek. Stworzono już linie komórek iPSC pochodzących od pacjentów z cukrzycą lub chorobą Parkinsona, lecz badania nad nimi są wciąż na etapie eksperymentalnym.

R13z4usUKEwuo

Zdjęcie przedstawia sieć neuronów. Zostały one otrzymane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Na zdjęciu sieć jest utkana z cienkich czerwonych połączonych ze sobą nitek. Nitki odchodzą od punktów świetlnych w kolorach niebieskim i zielonym. W ludzkim organizmie komórki nerwowe są podstawową jednostką budującą układ nerwowy.

Źródła komórek macierzystych

Komórki totipotencjalne i pluripotencjalne pozyskuje się z zarodków ludzkich uzyskanych metodą zapłodnienia in vitro niewykorzystanych w celu leczenia niepłodności, a także z zarodków uzyskanych poprzez klonowanie tkanki płodu po poronieniu czy aborcji. 

Rzh9wgZbgXBnz

Zdjęcie przedstawia kolonię ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Są one centralnie umiejscowione i na zdjęciu przypominają złocistą kulę. Wokół niej nieregularnie występują inne, większe komórki o podłużnym kształcie. Są to mysie fibroblasty – komórki tkanki łącznej.

Komórki macierzyste multipotencjalne izoluje się zwykle ze szpiku kostnego, łożyska i krwi pępowinowej, natomiast komórki unipotencjalne z niektórych narządów i tkanek, takich jak wątroba, jelito, skóra, rogówka i siatkówka oka. 

RpoNQDXWA4XO9

Zdjęcie przedstawia chondrocyty otrzymane z somatycznych komórek macierzystych. To zdjęcie spod mikroskopu konfokalnego. Na zdjęciu substancja międzykomórkowa wygląda jak zielone, cienkie nitki. Na zielonej warstwie tej substancji znajdują się niebieskie punkty świetle o owalnym kształcie. Niebieskie punkty to komórki tkanki chrzęstnej, czyli chondrocyty.

Choroby leczone z wykorzystaniem komórek macierzystych

Terapie wykorzystujące komórki macierzyste mają szerokie zastosowanie medyczne, umożliwiają bowiem wymianę starych komórek na nowe oraz regenerację tkanek i narządów.

Trwają badania nad otrzymywaniem z komórek pacjenta innych tkanek i narządów, które mogą zostać przeszczepione bez ryzyka odrzucenia przeszczepu, np. naczyń krwionośnych, tchawicy, chrząstek. Naprawa i hodowla tkanek oraz narządów są głównym celem medycyny regeneracyjnej. W ten sposób mogą być w przyszłości leczone odmrożenia czy złamania. Podejmowane są eksperymentalne próby leczenia chorób degeneracyjnych, np. terapia choroby Parkinsona.

Podsumowanie

• Poznanie sekwencji genomu człowieka w ramach Projektu Sekwencjonowania Genomu Ludzkiego stworzyło podstawy rozwoju diagnostyki molekularnej, która pozwala wykrywać choroby genetyczne, mutacje zwiększające ryzyko zachorowania oraz nosicielstwo wadliwych alleli.

• Badania molekularne wykorzystuje się w diagnostyce, prognozowaniu ryzyka chorób oraz w planowaniu działań profilaktycznych i terapeutycznych.

• Poradnictwo genetyczne służy ocenie ryzyka wystąpienia chorób dziedzicznych u osób obciążonych rodzinnie i ich potomstwa, na podstawie analizy rodowodów oraz wyników badań genetycznych.

• Terapia genowa polega na wprowadzeniu do komórek somatycznych prawidłowej wersji genu odpowiedzialnego za chorobę i może być prowadzona metodą ex vivo lub in vivo.

• Skuteczność terapii genowej zależy od trwałości ekspresji wprowadzonego genu i zdolności zmodyfikowanych komórek do podziałów.

• Komórki macierzyste charakteryzują się zdolnością do samoodnowy i różnicowania, co umożliwia regenerację tkanek i narządów.

• Komórki macierzyste pozyskuje się m.in. z zarodków, krwi pępowinowej, szpiku kostnego oraz niektórych tkanek dorosłego organizmu.

• Zastosowanie komórek macierzystych obejmuje leczenie chorób krwi, nowotworów, oparzeń oraz regenerację uszkodzonych tkanek i narządów

Ćwiczenia utrwalające