Grafika interaktywna
Jakie znasz metody wykrywania białek? Jakie odczynniki są do tego stosowane? Przeanalizuj grafikę interaktywną, a następnie rozwiąż ćwiczenie nr .
Czy znasz metody umożliwiające rozróżnienie poszczególnych aminokwasów i peptydów? Zapoznaj się z fiszkami, a następnie rozwiąż zadania.
Zapoznaj się z poniższymi informacjami dotyczącymi metod umożliwiających rozróżnianie poszczególnych aminokwasów i peptydów, a następnie wykonaj ćwiczenia sprawdzające.
Reakcja ninhydrynowa
Reakcja ninhydrynowa umożliwia wykrycie wolnych grup , które formują zasadę Schiffa (iminę) w reakcji z ninhydryną. W wyniku wieloetapowej reakcji zasada ta rozpada się z wydzieleniem -amino--hydroksy-H-inden--onu (aminokwasy tracą grupę aminową i ulegają dekarboksylacji do aldehydów krótszych o jeden atom węgla). Otrzymana pochodna aminoindenu ulega reakcji z kolejną cząsteczką ninhydryny, tworząc kolejną zasadę Schiffa o barwie fioletowoniebieskiej tzw. purpurę Ruhemanna.
Równanie reakcji ninhydrynowej:
Dwie cząsteczki ninhydryny zbudowanej z dwóch skondensowanych pierścieni – sześcioczłonowego pierścienia aromatycznego oraz pięcioczłonowego pierścienia nasyconego. Pierścienie te posiadają dwa atomy mostkowe, są one wspólne dla obu z nich. Pierścień pięcioczłonowy składa się z sąsiadujących ze sobą dwóch mostkowych atomów węgla. Każdy z nich łączy się z atomem węgla połączonym za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu. Wspomniane atomy węgla łączą się z tym samym atomem węgla podstawionym dwiema grupami hydroksylowymi, co zamyka pierścień pięcioczłonowy. Dodać cząsteczkę aminokwasu zbudowaną z grupy , do której przyłączone są łańcuch boczny , grupa aminowa oraz grupa karboksylanowa . Strzałka w prawo, pod strzałką minus cząsteczka tlenku węgla(), minus trzy cząsteczki wody, minus cząsteczka aldehydu zbudowanego z atomu węgla połączonego za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązań pojedynczych z podstawnikiem oraz z atomem wodoru. Za strzałką cząsteczka powstałego kompleksu zbudowanego z fragmentu pochodzącego od jednej cząsteczki ninhydryny, który to stanowi sześcioczłonowy pierścień aromatyczny, skondensowany z nim pierścień pięcioczłonowy, w którym jeden z dwóch związanych ze sobą atomów mostkowych łączy się z atomem węgla połączonym za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązania pojedynczego z atomem węgla, od którego odchodzi wiązanie pojedyncze poza pierścień wiążące go z atomem azotu oraz wiązanie podwójne wbudowane w pierścień i łączące go z atomem węgla, który wiążąc się z drugim atomem mostkowym, zamyka pierścień, a także podstawiony jest atomem tlenu obdarzonym ładunkiem ujemnym. Wspomniany wcześniej atom azotu łączy się za pomocą wiązania podwójnego z atomem węgla należącym do pięcioczłonowego pierścienia pochodzącego od drugiej cząsteczki ninhydryny. Atom ten związany jest z dwoma atomami węgla, z których każdy łączy się za pomocą wiązania podwójnego z jednym atomem tlenu oraz z jednym atomem mostkowym pierścienia. Atomy mostkowe łącza się ze sobą, budując jednocześnie fragment przyległego sześcioczłonowego pierścienia aromatycznego.
Reakcja cystynowa
Reakcja cystynowa pozwala na potwierdzenie obecności siarki cystyny i cysteiny w aminokwasach. Podczas ogrzewania białek z , ma miejsce hydroliza, podczas której zawarta w cystynie i cysteinie siarka zostaje uwolniona w postaci jonów siarczkowych, które z jonami dają czarny osad . Metionina (inny aminokwas siarkowy) nie prowadzi do dodatniego wyniku testu.
Wzór chemiczny cystyny:
Cystyna jest dimerem składającym się z dwóch cząsteczek cysteiny, które związane są wiązaniem pojedynczym łączącym atomy siarki. Zatem cystyna zbudowana jest dwóch połączonych ze sobą za pomocą wiązania pojedynczego atomów siarki, z których każdy łączy się z jedną grupą metylenową . Każda z grup metylenowych związana jest z grupą . Wspomniane atomy tworzące opisany szkielet zostały przedstawione w jedenj płaszczyźnie, to jest w płaszczyźnie monitora. Od atomu węgla znajdującego się po prawej stronie w prawą stronę, do góry, za płaszczyznę odchodzi wiązanie łączące go z grupą karboksylową , z kolei drugie wiązanie znajduje się w płaszczyźnie, odchodzi w prawą stronę do dołu i wiąże go z grupą aminową . Wracając do grupy znajdującej się po lewej stronie szkieletu, od należącego do niej atomu węgla przed płaszczyznę w lewą stronę, do góry, odchodzi wiązanie łączące go z grupą karboksylową. Z kolei drugie wiązanie znajduje się w płaszczyźnie, odchodzi w lewą stronę do dołu i łączy wspomniany atom węgla z grupą aminową .
Reakcja ksantoproteinowa
Reakcja ksantoproteinowa pozwala na wykrywanie ugrupowania aromatycznego w aminokwasach aromatycznych. Wynik pozytywny obserwujemy, gdy białko podczas ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym() dają żółte zabarwienie, a po dodaniu zasady lub amoniaku zmieniają kolor na pomarańczowy. Żółta barwa pochodzi od produktów nitrowania reszt aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny i tyrozyny) oraz tryptofanu, zawierającego również pierścień benzenowy, które wchodzą w skład białka.
Wiązanie N-glikozydowe pomiędzy asparaginą a grupą oligosacharydową w reakcji Libermanna
Reakcja Libermanna ma na celu wykrywanie obecności glikoprotein. Podczas ogrzewania ze stężonym roztworem ma miejsce hydroliza białka, wówczas cukry tworzą pochodne furfuralowe, które wraz z wydzielonymi fenolami powodują fioletowe zabarwienie roztworu.
Histydyna
Próba Pauly’ego stosowana w celu wykrywania pierścienia imidazolowego w histydynie i tyrozynie. W środowisku zasadowym pierścień imidazolowy obecny w histydynie w reakcji sprzęgania z jonem -sulfobenzenodiazioniowym prowadzi do uzyskania pomarańczowego barwnika, tak zwanego barwnika azowego.
Wzór szkieletowy histydyny zbudowany jest z atomu węgla połączonego z grupą karboksylową, grupą aminową, atomem wodoru oraz łańcuchem bocznym, który stanowi grupy metylenowa związana z pierścieniem imidazolowym, czyli pięcioczłonowym pierścieniem, który stanowią kolejno połączony z wspomnianą grupą metylenową atom węgla łączący się za pomocą wiązania pojedynczego z atomem azotu, który to za pomocą wiązania podwójnego łączy się z grupą . Grupa ta wiąże się z grupą związaną z kolejną grupą połączoną za pomocą wiązania podwójnego z wspomnianym na początku atomem węgla, co zamyka pięcioczłonowy pierścień.
Tyrozyna
W reakcji Millona białka, które posiadają odpowiednią grupę funkcyjną, barwią się na czerwono. Odczynnik Millona to roztwór azotanu rtęci() w stężonym kwasie azotowym(). Czerwone zabarwienie pochodzi od produktów reakcji reszt tyrozyny z kwasem azotawym i rtęcią. Reakcji ulegają białka zawierające resztę tyrozyny.
Wzór szkieletowy tyrozyny zbudowany jest z atomu węgla połączonego z grupą karboksylową, grupą aminową, atomem wodoru oraz łańcuchem bocznym, który stanowi grupa metylenowa połączona z pierścieniem fenylowym podstawionym w pozycji czwartej grupą hydroksylową .
Metionina
Metoda McCarthy‑Sullivana pozwala na wykrywanie metioniny. Reakcja przebiega ze stężonym , roztworem nitroprusydku sodu oraz glicyną. Roztwór ogrzewa się do temperatury czterdziestu‑osiemdziesięciu stopni Celsjusza i pozostawia na dziesięć minut, a następnie dodaje się stężonego . W probówce z metioniną pojawia się różowobrunatne zabarwienie.
Wzór szkieletowy metioniny zbudowany jest z atomu węgla połączonego z grupą karboksylową, grupą aminową, atomem wodoru oraz łańcuchem bocznym, który stanowią dwie kolejno połączone ze sobą grupy metylenowe, z których druga łączy się z atomem siarki podstawionym grupą metylową .
Cysteina
Reakcja z nitroprusydkiem sodu pozwala wykryć cysteinę. Do roztworu cysteiny dodaje się roztworu nitroprusydku sodu, następnie nasyca się go siarczanem() amonu i alkalizuje zasadą amonową. Pojawia się barwa czerwonofiołkowa.
Wzór szkieletowy cysteiny zbudowany jest z atomu węgla połączonego z grupą karboksylową, grupą aminową, atomem wodoru oraz łańcuchem bocznym, który stanowi grupa metylenowa połączona z grupą tiolową .
Tryptofan
Reakcja Voiseneta pozwala na wykrycie tryptofanu w białku. Do probówki wprowadza się roztwór tryptofanu, kroplę roztworu aldehydu mrówkowego oraz stężonego . Zawartość probówki należy wytrząsnąć, a następnie pozostawić w spokoju przez pięć minut. Po tym czasie dodaje się bardzo wolno kroplami roztwór azotanu() sodu. Pojawia się fiołkowe zabarwienie.
Wzór szkieletowy tryptofanu zbudowany jest z atomu węgla połączonego z grupą karboksylową, grupą aminową, atomem wodoru oraz łańcuchem bocznym, który stanowi grupa metylenowa podstawiona fragmentem pochodzącym od indolu, to jest dwupierścieniowej, heteroaromatycznej struktury składającej się z sześcioczłonowego i pięcioczłonowego pierścienia, w skład ostatniego wchodzi atom azotu, który sąsiaduje z jednym z dwóch mostkowych atomów węgla, to jest atomów wspólnych dla obu pierścieni.
Arginina
Reakcja Sakaguchi’ego pozwala na wykrycie w białku argininy. Do roztworu argininy dodaje się roztwór , dwie‑trzy krople roztworu -naftolu, a następnie należy wymieszać mieszaninę. Kolejno wprowadza się kroplę wody bromowej i obserwuje się różowopomarańczową barwę.
Wzór szkieletowy argininy zbudowany jest z atomu węgla połączonego z grupą karboksylową, grupą aminową, atomem wodoru oraz łańcuchem bocznym, który stanowią trzy kolejno połączone ze sobą grupy metylenowe , z których ostatnia wiąże się z grupą związaną z atomem węgla połączonym za pomocą wiązania podwójnego z kolejną grupą oraz za pomocą wiązania pojedynczego z grupą .