bg‑magenta

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)PCRReakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika powielania materiału genetycznego w postaci DNA w ilościach sięgających milionów, a nawet miliardów kopii. Podczas reakcji uzyskuje się niemal eksponencjalny wzrost liczby kopii DNA, których długość wynosi od kilkuset do kilku tysięcy par zasad (w specyficznych warunkach). Metoda reakcji PCR opiera się na wielokrotnym powtarzaniu określonych etapów, które zachodzą w różnych temperaturach, a każda zmiana temperatury wyznacza koniec danego etapu. Proces ten został opracowany w USA w 1983 r. przez zespół Kary’ego Mullisa. Mullis w 1993 r. otrzymał za PCR Nagrodę Nobla.

Łańcuchową reakcję polimerazy przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o zdefiniowanym składzie.

RngpQyChtEXue1
Wymyśl pytanie na kartkówkę związane z tematem materiału.

W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi matrycowe DNA, które posłuży jako podstawa do namnożenia określonego fragmentu. Może to być DNA genomowe wyizolowane z danego organizmu, plazmid, izolat DNA z próbki biologicznej o nieznanej sekwencji czy wcześniej uzyskany fragment DNA.

Przed użyciem danej próbki jako matrycy w reakcji PCR warto określić jej stężenie oraz czystość. Zbyt duże stężenie DNA matrycowego może wpłynąć negatywnie na przebieg reakcji. Ten sam skutek może wywołać zanieczyszczenie próbki odczynnikami chemicznymi, które zostały zastosowane podczas izolacji materiału genetycznego.

W zależności od celu wykorzystania reakcji PCR projektuje się odpowiednie startery (primery), które pozwalają na wyznaczenie końców powielanej sekwencji DNA i umożliwiają przyłączenie enzymu – polimerazy DNA. Startery to krótkie sekwencje DNA, zawierające zazwyczaj  ok. 20 nukleotydów (w zależności od zastosowania techniki PCR liczba nukleotydów w starterach może być inna). Aby powielić fragment DNA, niezbędne są dwa startery, określane jako przedni (ang. forward) oraz wsteczny (ang. reverse). Starter przedni jest identyczny z sekwencją powielaną, a starter wsteczny to odcinek do niej komplementarny.

Ważnym parametrem stosowanych starterów jest ich temperatura topnienia (Tm)temperatura topnieniatemperatura topnienia (Tm). Parametr ten posłuży do ustalenia temperatury przyłączania starterów do matrycy w czasie reakcji.

Prosty wzór, pozwalający na obliczenie Tm startera, to:
Tm = [2 °C x (A + T) + 4 °C x (G + C)],
gdzie A+T oznacza sumę adenin i tymin w sekwencji, a G + C to suma guanin i cytozyn.

Obecność starterów pozwala na przyłączenie do kompleksu DNA‑starter polimerazy DNA. Jest to enzym, który odpowiada za katalizowanie syntezy DNA na matrycy DNA (polimeraza DNA zależna od DNA). W przypadku reakcji PCR używa się termostabilnych polimeraz DNA, które nie ulegają denaturacji w wysokich temperaturach. Jest to szczególnie ważna cecha – denaturację DNA w reakcji PCR osiąga się przez ogrzanie mieszaniny do temperatury 95–98°C. Do polimeraz opornych na działanie wysokiej temperatury zalicza się polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus. Polimeraza Taq osiąga optimum swojej aktywności w przedziale 75–80°C, lecz najczęściej stosowana temperatura w etapie wydłużania (gdy polimeraza jest aktywna) to 72°C. Podczas syntezy nowych nici DNA polimeraza zużywa nukleotydy, które dostarczone są w postaci mieszaniny. Mieszanina ta często opisywana jest jako dNTP (trifosforany deoksynukleotydów), a w jej skład wchodzą: dATP, gGTP, dCTP oraz dTTP, odpowiadając kolejno: nukleotydowi adeninowemu, guaninowemu, cytozynowemu i tyminowemu. Trifosforany deoksynukleotydów dostarczane są do mieszaniny reakcyjnej w nadmiarze, a przy nieudanej reakcji PCR można zaobserwować ich obecność po analizie elektroforetycznej w postaci charakterystycznej „chmury”.

Do prawidłowej pracy polimerazy niezbędne jest zapewnienie odpowiednich warunków, czemu służy dodanie do mieszaniny reakcyjnej buforu. Każda polimeraza do reakcji PCR ma przypisany do siebie bufor, który zawiera np. niezbędne do aktywności enzymu jony. Ponadto bufor odpowiada za zapewnienie odpowiedniego pH mieszaniny reakcyjnej. Dla prawidłowego działania polimerazy Taq niezbędne są jony magnezu (MgIndeks górny 2+). Częstym składnikiem buforów są także barwniki, które pozwalają na śledzenie migracji DNA w czasie elektroforezy. Całość przygotowanej mieszaniny powinna mieścić się w zakresie 10–50 µL – końcową objętość próbki uzyskuje się przez dodanie ultraczystej wody laboratoryjnej.

Komercyjnie dostępne są mieszaniny do reakcji PCR, które zawierają wszystkie niezbędne niezmienne składniki reakcji oprócz DNA matrycowego oraz starterów. Każda z mieszanin opatrzona jest opisem wykorzystanej w niej polimerazy oraz zalecanych warunków przeprowadzania reakcji. Mieszaniny te wymagają rozcieńczenia wodą, gdyż przygotowane są w formie zatężonej. Pozwala to na dodanie różnych ilości matrycowego DNA oraz starterów w zależności od ich stężenia.

Przygotowaną mieszaninę reakcyjną umieszcza się w małych probówkach, zwanych także PCR‑ówkami. Probówki te są następnie wkładane do termocykleratermocyklertermocyklera. Urządzenia tego rodzaju wyposażone są w bloki grzejne, które odpowiadają za ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej do odpowiedniej temperatury. Ponad komorą z blokiem grzejnym znajduje się zamykana pokrywa z funkcją grzania. Ustawienie wysokiej temperatury pokrywy pozwala zapobiec parowaniu mieszaniny i skraplaniu się na wieczku PCR‑ówki. Termocykler ma także oprogramowanie, na którym można ustalić przebieg reakcji PCR, liczbę cykli oraz wartość temperatury i czas trwania poszczególnych etapów.

bg‑magenta

Przebieg PCR

Reakcja PCR składa się z trzech etapów:

R14i977WmgDXu1
Ilustracja interaktywna przedstawia proces PCR. Reakcja PCR to metoda powielania łańcuchów DNA, która polega na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w warunkach laboratoryjnych w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Do reakcji doprowadza genomowy DNA (którego fragment ma być powielony) z interesującej nas sekwencji. Ukazana jest podwójna helisa. Cykl pierwszy: W pierwszym etapie procesu dochodzi do denaturacji i rozplecenia podwójnej helisy. W drugim etapie dochodzi do przyłączenia starterów (hybrydyzacji) i stworzenia odcinków dwuniciowych. W trzecim etapie dochodzi do wydłużania łańcucha (elongacji) i dochodzi do właściwej syntezy DNA. W cyklu pierwszym powstają dwie cząsteczki DNA. Cykl drugi: w jego wyniku powstają cztery cząsteczki DNA. Cykl trzeci: w jego wyniku powstaje osiem cząsteczek, z których dwie idealnie odpowiadają interesującej nas sekwencji. Opis punktów znajdujących się na ilustracji: 1. Denaturacja Mieszanina reakcyjna zostaje podgrzana do 95°C. W tej temperaturze dochodzi do denaturacji matrycowego DNA. Rozerwaniu ulegają wiązania wodorowe i helisa ulega rozpleceniu. Efektem tego jest otrzymanie jednoniciowych fragmentów DNA, do których mogą przyłączyć się sekwencje starterów. Działanie wysoką temperaturą na DNA trwa ok 15 sekund., 2. Przyłączanie (hybrydyzacja; ang. annealing) Temperatura mieszaniny ulega obniżeniu do 40°C – 60°C, w zależności od obliczonej temperatury topnienia starterów. Startery samoistnie odnajdują komplementarne sekwencje na jednoniciowych fragmentach DNA. Dodatek nadmiaru starterów do mieszaniny zapewnia wysokie prawdopodobieństwo przyłączenia tych sekwencji do nici matrycowych, w porównaniu do połączenia pojedynczych nici DNA w helisę. Dzięki utworzonemu kompleksowi DNA-starter możliwe jest przyłączenie polimerazy DNA. Etap hybrydyzacji trwa około 20 sekund., 3. Elongacja Temperatura mieszaniny ustawiana jest w zakresie optimum działania enzymu, który został użyty w reakcji, np. 72°C dla polimerazy Taq. Dzięki stworzonej w etapie annealingu strukturze dwuniciowej (DNA-starter) możliwe jest rozpoczęcie pracy przez polimerazę, która syntetyzuje komplementarną nić przy użyciu dostarczonych do mieszaniny dNTP. Etap ten to właściwa synteza DNA prowadząca do jego zwielokrotnienia. Czas trwania wydłużania zależny jest od wydajności użytej polimerazy (ilości dobudowywanych nukleotydów do nowej nici w jednostce czasu) oraz wielkości spodziewanego produktu.
Przebieg reakcji PCR.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.

Wszystkie trzy etapy powtarzane są cyklicznie ok. 25–35 razy. Z każdym kolejnym cyklem zwiększa się ilość matrycy, na bazie której syntezowane są nowe odcinki DNA. Efektem tego jest niemal eksponencjalny wzrost liczby kopii DNA, którego końce wyznaczone zostały sekwencjami starterów. Nie jest jednak zalecane nadmierne powtarzanie cykli ze względu na wzrastające prawdopodobieństwo błędów wynikających z nieprawidłowej pracy polimerazy.

Po zakończeniu ustalonej liczby cykli przeprowadza się elongację kończącą. Etap ten zachodzi w tych samych warunkach, co zwykła elongacja, lecz wydłuża się czas jej trwania. Zapewnia to polimerazie, która syntezuje wszystkie nieskończone wcześniej fragmenty DNA, odpowiedni czas działania. Cały proces może trwać kilka godzin.

Ostatnim etapem, który można ustawić w programie termocyklera, to chłodzenie. Temperatura bloku grzejnego spada wtedy do 4°C, dzięki czemu pozostawione w aparaturze DNA nie ulega szybkiej degradacji.

bg‑magenta

Zalety i wady PCR

Zalety
  • szybkość reakcji,

  • niskie koszty,

  • wysoka czułość – wykrywa pojedynczą cząsteczkę DNA,

  • specyficzność; pozwala na powielanie jednego, określonego odcinka DNA (pod warunkiem doboru odpowiednich starterów).

Wady
  • ograniczenia związane z długością powielanego odcinka,

  • możliwość wprowadzenia zmiany w sekwencji przez polimerazę DNA,

  • łatwość zanieczyszczenia próbki obcym DNA, co skutkuje fałszywym wynikiem.

bg‑magenta

Wykorzystanie PCR

Możliwość szybkiego powielenia materiału genetycznego w reakcji PCR umożliwia jej  wykorzystanie w wielu dziedzinach. Jest jednym z podstawowych narzędzi w biotechnologii; służy m.in. do namnażania genów, tworzenia konstruktów do delecji lub nadekspresji genów, genotypowania, wykrywania mutacji czy identyfikacji mikroorganizmów. Modyfikacja reakcji PCR (qRT‑PCR – ilościowa reakcja łańcuchowej polimerazy) pozwala na analizę ekspresji genów oraz na powielenie DNA z bezcennych i niepowtarzalnych próbek, np. pochodzących z wykopalisk archeologicznych.

W medycynie reakcja PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce chorób (poprzez wykrywanie genów organizmów patogennych), także prenatalnie, onkologii (analiza profili ekspresji genów związanych z procesami nowotworzenia), transplantologii (wykrywanie zakażenia cytomegalowirusem), czy ustalaniu rodzicielstwa.

Technika PCR to także przydatne narzędzie w walce z przestępczością. Analiza śladów DNA pozostawionych na miejscu przestępstw pozwala na wykluczenie lub wskazanie potencjalnego sprawcy (przez analizę porównawczą namnożonych w reakcji PCR krótkich sekwencji tandemowych), a także ustalenie tożsamości osób zaginionych lub odnalezionych zwłok.

Słownik

denaturacja DNA
denaturacja DNA

separacja dwuniciowej helisy DNA na fragmenty jednoniciowe; zachodzi dzięki zerwaniu wiązań wodorowych na skutek działania wysokiej temperatury; proces odwracalny

elongacja
elongacja

synteza komplementarnej nici DNA na bazie DNA matrycowego przez polimerazę DNA

przyłączanie, hybrydyzacja
przyłączanie, hybrydyzacja

(ang. annealing) proces przyłączania sekwencji starterowych do jednoniciowego DNA matrycowego, w wyniku tworzy się kompleks DNA‑starter

PCR
PCR

ang. polymerase chain reaction; reakcja łańcuchowej polimerazy; technika laboratoryjna biologii molekularnej pozwalająca na powielanie wybranego odcinka DNA in vitro

temperatura topnienia
temperatura topnienia

temperatura, w której połowa z nici DNA występuje w postaci jednoniciowej; temperatura równowagi pomiędzy stanem dwuniciowym a jednoniciowym DNA, umożliwiająca przyłączenie sekwencji starterowej do pojedynczych nici

termocykler
termocykler

urządzenie laboratoryjne służące do przeprowadzenia reakcji PCR, zaopatrzone w blok grzejny, w którym umieszcza się probówki z mieszaniną reakcyjną; zapewnia optymalną temperaturę dla każdego z etapów reakcji, zdefiniowaną we wcześniej zaprogramowanych ustawieniach

termostabilna polimeraza
termostabilna polimeraza

enzym syntetyzujący wydłużanie nici DNA o podwyższonej oporności na wysoką temperaturę (95°C), w której nie ulega denaturacji

trifosforany deoksyrybonukleozydowe
trifosforany deoksyrybonukleozydowe

zmodyfikowane nukleozydy zbudowane z trzech reszt kwasu fosforowego połączonych dwoma wiązaniami wysokoenergetycznymi