Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)PCRReakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika powielania materiału genetycznego w postaci DNA w ilościach sięgających milionów, a nawet miliardów kopii. Podczas reakcji uzyskuje się niemal eksponencjalny wzrost liczby kopii DNA, których długość wynosi od kilkuset do kilku tysięcy par zasad (w specyficznych warunkach). Metoda reakcji PCR opiera się na wielokrotnym powtarzaniu określonych etapów, które zachodzą w różnych temperaturach, a każda zmiana temperatury wyznacza koniec danego etapu. Proces ten został opracowany w USA w 1983 r. przez zespół Kary’ego Mullisa. Mullis w 1993 r. otrzymał za PCR Nagrodę Nobla.

Łańcuchową reakcję polimerazy przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o zdefiniowanym składzie.

W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi matrycowe DNA, które posłuży jako podstawa do namnożenia określonego fragmentu. Może to być DNA genomowe wyizolowane z danego organizmu, plazmid, izolat DNA z próbki biologicznej o nieznanej sekwencji czy wcześniej uzyskany fragment DNA.

Przed użyciem danej próbki jako matrycy w reakcji PCR warto określić jej stężenie oraz czystość. Zbyt duże stężenie DNA matrycowego może wpłynąć negatywnie na przebieg reakcji. Ten sam skutek może wywołać zanieczyszczenie próbki odczynnikami chemicznymi, które zostały zastosowane podczas izolacji materiału genetycznego.

W zależności od celu wykorzystania reakcji PCR projektuje się odpowiednie startery (primery), które pozwalają na wyznaczenie końców powielanej sekwencji DNA i umożliwiają przyłączenie enzymu – polimerazy DNA. Startery to krótkie sekwencje DNA, zawierające zazwyczaj  ok. 20 nukleotydów (w zależności od zastosowania techniki PCR liczba nukleotydów w starterach może być inna). Aby powielić fragment DNA, niezbędne są dwa startery, określane jako przedni (ang. forward) oraz wsteczny (ang. reverse). Starter przedni jest identyczny z sekwencją powielaną, a starter wsteczny to odcinek do niej komplementarny.

Ważnym parametrem stosowanych starterów jest ich temperatura topnienia (Tm)temperatura topnieniatemperatura topnienia (Tm). Parametr ten posłuży do ustalenia temperatury przyłączania starterów do matrycy w czasie reakcji.

Prosty wzór, pozwalający na obliczenie Tm startera, to:
Tm = [2 °C x (A + T) + 4 °C x (G + C)],
gdzie A+T oznacza sumę adenin i tymin w sekwencji, a G + C to suma guanin i cytozyn.

Obecność starterów pozwala na przyłączenie do kompleksu DNA‑starter polimerazy DNA. Jest to enzym, który odpowiada za katalizowanie syntezy DNA na matrycy DNA (polimeraza DNA zależna od DNA). W przypadku reakcji PCR używa się termostabilnych polimeraz DNA, które nie ulegają denaturacji w wysokich temperaturach. Jest to szczególnie ważna cecha – denaturację DNA w reakcji PCR osiąga się przez ogrzanie mieszaniny do temperatury 95–98°C. Do polimeraz opornych na działanie wysokiej temperatury zalicza się polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus. Polimeraza Taq osiąga optimum swojej aktywności w przedziale 75–80°C, lecz najczęściej stosowana temperatura w etapie wydłużania (gdy polimeraza jest aktywna) to 72°C. Podczas syntezy nowych nici DNA polimeraza zużywa nukleotydy, które dostarczone są w postaci mieszaniny. Mieszanina ta często opisywana jest jako dNTP (trifosforany deoksynukleotydów), a w jej skład wchodzą: dATP, gGTP, dCTP oraz dTTP, odpowiadając kolejno: nukleotydowi adeninowemu, guaninowemu, cytozynowemu i tyminowemu. Trifosforany deoksynukleotydów dostarczane są do mieszaniny reakcyjnej w nadmiarze, a przy nieudanej reakcji PCR można zaobserwować ich obecność po analizie elektroforetycznej w postaci charakterystycznej „chmury”.

Do prawidłowej pracy polimerazy niezbędne jest zapewnienie odpowiednich warunków, czemu służy dodanie do mieszaniny reakcyjnej buforu. Każda polimeraza do reakcji PCR ma przypisany do siebie bufor, który zawiera np. niezbędne do aktywności enzymu jony. Ponadto bufor odpowiada za zapewnienie odpowiedniego pH mieszaniny reakcyjnej. Dla prawidłowego działania polimerazy Taq niezbędne są jony magnezu (MgIndeks górny 2+²⁺). Częstym składnikiem buforów są także barwniki, które pozwalają na śledzenie migracji DNA w czasie elektroforezy. Całość przygotowanej mieszaniny powinna mieścić się w zakresie 10–50 µL – końcową objętość próbki uzyskuje się przez dodanie ultraczystej wody laboratoryjnej.

Komercyjnie dostępne są mieszaniny do reakcji PCR, które zawierają wszystkie niezbędne niezmienne składniki reakcji oprócz DNA matrycowego oraz starterów. Każda z mieszanin opatrzona jest opisem wykorzystanej w niej polimerazy oraz zalecanych warunków przeprowadzania reakcji. Mieszaniny te wymagają rozcieńczenia wodą, gdyż przygotowane są w formie zatężonej. Pozwala to na dodanie różnych ilości matrycowego DNA oraz starterów w zależności od ich stężenia.

Przygotowaną mieszaninę reakcyjną umieszcza się w małych probówkach, zwanych także PCR‑ówkami. Probówki te są następnie wkładane do termocykleratermocyklertermocyklera. Urządzenia tego rodzaju wyposażone są w bloki grzejne, które odpowiadają za ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej do odpowiedniej temperatury. Ponad komorą z blokiem grzejnym znajduje się zamykana pokrywa z funkcją grzania. Ustawienie wysokiej temperatury pokrywy pozwala zapobiec parowaniu mieszaniny i skraplaniu się na wieczku PCR‑ówki. Termocykler ma także oprogramowanie, na którym można ustalić przebieg reakcji PCR, liczbę cykli oraz wartość temperatury i czas trwania poszczególnych etapów.

Reakcja PCR składa się z trzech etapów:

• denaturacjidenaturacja DNAdenaturacji,

• przyłączaniaprzyłączanie, hybrydyzacjaprzyłączania,

• elongacjielongacjaelongacji.

Wszystkie trzy etapy powtarzane są cyklicznie ok. 25–35 razy. Z każdym kolejnym cyklem zwiększa się ilość matrycy, na bazie której syntezowane są nowe odcinki DNA. Efektem tego jest niemal eksponencjalny wzrost liczby kopii DNA, którego końce wyznaczone zostały sekwencjami starterów. Nie jest jednak zalecane nadmierne powtarzanie cykli ze względu na wzrastające prawdopodobieństwo błędów wynikających z nieprawidłowej pracy polimerazy.

Po zakończeniu ustalonej liczby cykli przeprowadza się elongację kończącą. Etap ten zachodzi w tych samych warunkach, co zwykła elongacja, lecz wydłuża się czas jej trwania. Zapewnia to polimerazie, która syntezuje wszystkie nieskończone wcześniej fragmenty DNA, odpowiedni czas działania. Cały proces może trwać kilka godzin.

Ostatnim etapem, który można ustawić w programie termocyklera, to chłodzenie. Temperatura bloku grzejnego spada wtedy do 4°C, dzięki czemu pozostawione w aparaturze DNA nie ulega szybkiej degradacji.

Możliwość szybkiego powielenia materiału genetycznego w reakcji PCR umożliwia jej  wykorzystanie w wielu dziedzinach. Jest jednym z podstawowych narzędzi w biotechnologii; służy m.in. do namnażania genów, tworzenia konstruktów do delecji lub nadekspresji genów, genotypowania, wykrywania mutacji czy identyfikacji mikroorganizmów. Modyfikacja reakcji PCR (qRT‑PCR – ilościowa reakcja łańcuchowej polimerazy) pozwala na analizę ekspresji genów oraz na powielenie DNA z bezcennych i niepowtarzalnych próbek, np. pochodzących z wykopalisk archeologicznych.

W medycynie reakcja PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce chorób (poprzez wykrywanie genów organizmów patogennych), także prenatalnie, onkologii (analiza profili ekspresji genów związanych z procesami nowotworzenia), transplantologii (wykrywanie zakażenia cytomegalowirusem), czy ustalaniu rodzicielstwa.

Technika PCR to także przydatne narzędzie w walce z przestępczością. Analiza śladów DNA pozostawionych na miejscu przestępstw pozwala na wykluczenie lub wskazanie potencjalnego sprawcy (przez analizę porównawczą namnożonych w reakcji PCR krótkich sekwencji tandemowych), a także ustalenie tożsamości osób zaginionych lub odnalezionych zwłok.

Słownik