Istnieje wiele testów chemicznych pozwalających na wykrycie obecności białka w pożywieniu. Można je podzielić na dwa rodzaje: testy jakościowetesty jakościowetesty jakościowe i ilościowetesty ilościoweilościowe. Testy ilościowe określają ilość białka w badanej próbce – odpowiadają na pytanie „ile?”. Natomiast testy jakościowe określają występowanie lub brak białek w żywności. Omówimy teraz jedną z podstawowych metod wykrywania wiązań peptydowychwiązania amidowe (peptydowe)wiązań peptydowych.

Ta metoda pozwala na wykrycie wiązania amidowego (peptydowego) w białkach. Warunkiem koniecznym do zajścia reakcji jest występowanie co najmniej dwóch wiązań peptydowych, czyli w reakcji tej nie możemy wykryć:

• aminokwasów (które nie zawierają wiązania peptydowego),

• dipeptydów (które zawierają jedno wiązanie peptydowe).

Metoda wzięła swoją nazwę od biuretu – dimeru mocznika, który jest najprostszym związkiem dającym pozytywny wynik.

RMwIhbu441JIQ

Ilustracja przedstawiająca wzór strukturalny biuretu, który to jest dimerem mocznika. Związek ten zbudowany jest z grupy ${\text{NH}}_2$ połączonej z atomem węgla, który to łączy się za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązania pojedynczego z grupą $\text{NH}$. Grupa ta związana jest z kolejnym atomem węgla również połączonym za pomocą wiązania podwójnego z atomem tlenu oraz za pomocą wiązania pojedynczego z grupą ${\text{NH}}_2$. Wiązania pojedyncze pomiędzy atomami azotu oraz grupami C wiązanie podwójne O, to wiązania amidowe (peptydowe). Zatem w omawianej strukturze znajdują się cztery takie wiązania.

Wiązania peptydowe reagują z jonami miedzi($\text{II}$) w roztworze o odczynie zasadowym. W tym celu do roztworu białka można dodać siarczan($\text{VI}$) miedzi($\text{II}$) (${\text{CuSO}}_4$) z wodorotlenkiem sodu ($\text{NaOH}$) lub wodorotlenkiem potasu ($\text{KOH}$).

R1K669P7NU5A2

Ilustracja przedstawiająca dwie probówki. W pierwszej z nich znajduje się roztwór białka o barwie jasnożółtej. Od pierwszej probówki prowadzona jest strzałka do drugiej, w której znajduje się białko z dodatkiem siarczanu(sześć) miedzi(dwa) C u S O indeks dolny, cztery, koniec indeksu dolnego oraz wodorotlenku sodu N a O H, omawiany roztwór ma barwę jasnofioletową, zwaną fiołkową.

RN1WApyxJ0j18

Ilustracja przedstawiająca strukturę kompleksu peptydu z jonem miedzi na drugim stopniu utlenienia. Atom centralny stanowi C u indeks górny, dwa, plus, koniec indeksu górnego. Jest on związany z czterema atomami azotu z ujemnymi ładunkami za pomocą wiązań koordynacyjnych, te atomy azotu pochodzą od zdeprotonowanych grup N H w cząsteczkach dwóch peptydów. Dwa atomy azotu od jednej cząsteczki peptydu, dwa atomy azotu od drugiej cząsteczki peptydu. Wiązania te podpisane są jako wiązania donorowo‑akceptorowe. Dwie cząsteczki peptydu są przedstawione identycznymi wzorami ogólnymi. Struktura peptydu jest następująca: ukazany jest fragment peptydu połączony z grupą karbonylową, w której atom węgla połączony jest z atomem azotu z ujemnym ładunkiem, który to oprócz wiązania koordynacyjnego posiada wiązanie do grupy C H połączonej z resztą R i grupą karbonylową, która połączona jest z kolejnym atomem azotu z ujemnym ładunkiem. Ten atom azotu oprócz wiązania koordynacyjnego połączony jest z dalszym fragmentem peptydu, który na pierwszym rozgałęzieniu przyłączony jest do reszty R. Całość kompleksu wzięta w kwadratowy nawias i sumaryczny ładunek wynosi <math aria‑label=minus dwa">-2.

Wiązanie donorowo‑akceptorowewiązanie donorowo‑akceptoroweWiązanie donorowo‑akceptorowe to rodzaj wiązania chemicznego, w którym wiążąca para elektronowa pochodzi tylko od jednego atomu (w tym przypadku azotu $—\text{N}$). Wyróżnia się:

• donora – dawcę wolnej pary elektronowej – w tym przypadku jest to atom azotu z grupy $—\text{NH}$;

• akceptora – jon metalu będący biorcą pary elektronowej – jon miedzi (${\text{Cu}}^{2+}$).

RIYuYZBfsNYCs

Ilustracja przedstawiająca pięć kolejno ustawionych obok siebie probówek. Wszystkie są wypełnione w trzech czwartych roztworami, od najjaśniejszego po lewej stronie przez bladofioletowe, fiołkowe i wreszcie najbardziej po prawej stronie do koloru fioletowego.

Powstający związek kompleksowyzwiązek kompleksowyzwiązek kompleksowy ma fioletową barwę, a jego intensywność jest wprost proporcjonalna do ilości wiązań peptydowych w badanej próbce. Jest to reakcja kolorymetryczna. To znaczy, że jeżeli w roztworze obecne są związki zawierające bliskie wiązania amidowe (peptydowe), to roztwór zmienia barwę z niebieskiej na fioletową. Jest to spowodowane powstawaniem anionowych związków kompleksowych, w których jon ${\text{Cu}}^{2+}$ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe. W przypadku występowania dimerów aminokwasów, w których jest tylko jedno wiązanie peptydowe, układ zabarwia się na różowo. Wolne aminokwasy nie zmieniają barwy roztworu. Test może być stosowany zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej. W tym drugim przypadku wykorzystuje się liniową zależność zmiany barwy od stężenia protein, a w rzeczywistości od liczby podwójnych wiązań peptydowych. W oznaczeniu przeszkadzają: sole amonowe (dają barwne kompleksy z jonami miedzi) oraz siarczan($\text{VI}$) magnezu (przechodzi w nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu, który maskuje właściwą barwę).

RyLpxPdxyjbuD1

Zdjęcie przedstawiające spektrofotometr. Po prawej stronie urządzenia jest wyświetlacz, na którym znajduje się spektrum, to jest wykres otrzymany w wyniku pomiaru spektrofotometrycznego, pod wyświetlaczem znajdują się przyciski umożliwiające obsługę urządzenia, jego kalibrację czy pomiar. Lewa strona urządzenia to komora pomiarowa, która jest zakryta pokrywą. Znajduje się w niej między innymi źródło światła, układ optyczny, specjalne miejsce na kuwetę, w której umieszczana jest próbka, a także detektory.

W ten sposób można obliczyć stężenie białka w badanym roztworze. Zmianę zabarwienia określa się za pomocą spektrofotometru, który mierzy ilość światła pobieranego przez próbkę. Na ilustracji po lewej stronie jest przedstawiony spektrofotometr do pomiaru barwy.

Reakcja biuretowa jest powszechnie wykorzystywana w laboratoriach diagnostycznych. Za jej pomocą określa się obecność białek w płynach ustrojowych, np. krwi. Ponadto można również zbadać występowanie protein w moczu, dzięki czemu można się dowiedzieć o nieprawidłowym działaniu nerek.

Istnieją różne metody, które umożliwiają wykrycie konkretnych aminokwasów w danej próbce. Przykładowo: te, które w swojej budowie posiadają siarkę – dają pozytywny wynik reakcji cystynowej. Nie są to jednak reakcje charakterystyczne jedynie dla białek. Liczne testy chemiczne wykonywane w laboratoriach określają rodzaj oraz ilość białek w pożywieniu. Wykorzystuje się je przy produkcji żywności. Takie informacje między innymi ułatwiają planowanie zróżnicowanych posiłków.

Słownik

Bibliografia

Doonan S., Zawadzki Z., Białka i peptydy, Warszawa 2008.

Kłyszejko–Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii, 2003.

Stryer L., Berg J. M., Tymoczko J. L., Molekularny wzór życia. Część 1. Biochemia, Warszawa 2009, wyd. 4.