Do obserwacji struktur tkankowych i komórkowych używa się głównie mikroskopów (z gr. mikros – mały, skopeo – patrzę, obserwuję) – przyrządów optycznych pozwalających na otrzymywanie powiększonych obrazów obiektów niewidocznych gołym okiem. Najczęściej stosowanym mikroskopem do obserwacji tkanek roślinnych jest mikroskop świetlny, który wykorzystuje wiązkę światła przechodzącą przez specjalny układ optyczny, tworzony przez zestaw soczewek umieszczonych w obiektywie i okularze.

Taka obserwacja jest jednak utrudniona, gdyż komórki i ich elementy nie wykazują różnic w absorpcji promieniowania elektromagnetycznego. Przekłada się to na brak wyraźnego kontrastu między poszczególnymi elementami. Nie ma więc możliwości rozróżnienia szczegółów budowy danej tkanki czy też elementów komórki. Z tego powodu w preparatach mikroskopowych niezbędne jest zastosowanie barwników histologicznych, które wybarwiają komórki wraz z ich elementami strukturalnymi, a tym samym umożliwiają ich dokładną obserwację i identyfikację.

Barwniki histologiczne to związki chemiczne wykorzystywane w mikroskopii świetlnej do wybarwiania struktur komórkowych i tkankowych. Typowy barwnik zawiera dwie grupy chemiczne: chwytną i barwną. Część chwytna łączy się z elementami komórkowymi o określonym składzie chemicznym, natomiast barwna absorbuje światło o określonej długości fali, dzięki czemu możliwe jest dostrzeżenie wybarwionych struktur.

W zależności od struktury, jaką się będzie obserwować, należy zastosować odpowiedni barwnik histologiczny. Do wykrywania amyloplastów, czyli leukoplastów magazynujących skrobię, stosuje się jodek w jodku potasu, który barwi skrobię na kolor od jasnoniebieskiego do granatowego. Celulozowe ściany komórkowe wykrywa się za pomocą roztworu chlorku cynku z jodem, pod wpływem którego ściany komórkowe zbudowane z celulozy wybarwiają się na kolor fioletowy. Ściany komórkowe inkrustowane ligniną po zastosowaniu floroglucyny z kwasem solnym barwią się na kolor czerwony. Natomiast ściany komórkowe adkrustowane suberyną pod wpływem sudanu III nabierają barwy żółtoczerwonej.

Aby odróżnić od siebie poszczególne struktury komórkowe i tkankowe, dany preparat należy potraktować jednocześnie dwoma różnymi barwnikami – jest to tzw. barwienie różnicowe. Dzięki tej technice można odróżnić m.in. zdrewniałe ściany komórkowe, które pod wpływem safraninysafraninasafraniny barwią się na kolor czerwony, od celulozowych ścian komórkowych, które pod wpływem zieleni świetlistej barwią się na kolor niebieskozielony. Innym przykładem barwników stosowanych w barwieniu różnicowym są: karmin ałunowy, barwiący ściany celulozowe na kolor czerwony, oraz zieleń metylenowa, barwiąca zdrewniałe ściany komórkowe na kolor zielony.

Najczęściej stosowanymi barwnikami w histologii są hematoksylinahematoksylinahematoksylina oraz eozynaeozynaeozyna (H+E).

• Hematoksylina to niebieski barwnik, którym wykrywa się kwasowe (zasadochłonne) elementy komórki, takie jak jądro komórkowe czy siateczka śródplazmatyczna szorstka. Zazwyczaj stosowana jest w połączeniu z eozyną.

• Eozyna to kwasowy barwnik o czerwonej barwie służący do wykrywania zasadowych (kwasochłonnych) struktur komórkowych, takich jak cytoplazma.

• Naklejone i odparafinowane skrawki nawodnij w szeregu alkoholowym.

• Umieść skrawki na 2–3 minuty w wodzie destylowanej.

• Zanurzaj skrawki przez 4–5 minut w roztworze hematoksylinyhematoksylinahematoksyliny (im starszy barwnik, tym krócej).

• Przebarwione skrawki odbarw przez 2–3 sekundy w zakwaszonym alkoholu (0,25 ml HCl na 100 ml alkoholu 70%).

• Przepłucz preparat pod bieżącą wodą lub umieść w wodzie z kilkoma kroplami nasyconego roztworu węglanu litu, aż do uzyskania niebieskiego zabarwienia jąder komórkowych (kontrola pod mikroskopem lub do widocznej makroskopowo zmiany zabarwienia skrawka).

• Zanurz skrawki w roztworze eozynyeozynaeozyny przez 1 minutę.

• Przepłucz wodą destylowaną.

• Zamknij skrawek w medium na bazie wody (np. glicerożelatyna).

Elementy zasadochłonne (np. jądra komórkowe) barwią się na niebiesko, a elementy kwasochłonne na czerwono.

• Jądra komórkowe (chromatyna): barwa niebieska

• Cytoplazma: barwa różowa

• Dodaj 20 mg safraninysafraninasafraniny w proszku do zlewki o pojemności 100 ml.

• Wlej 20 ml wody destylowanej do zlewki i przez ciągłe mieszanie przygotuj 0,1‑procentowy roztwór barwiący safraniny.

• Przenieś 20 mg zieleni trwałejzieleń trwałazieleni trwałej do innej zlewki o pojemności 100 ml.

• Dodaj do niej 20 ml wody destylowanej i przygotuj 0,1‑procentowy roztwór barwiący.

• Przefiltruj oba roztwory barwiące.

• Nawodnij preparaty po deparafinizacji (przeprowadź przez szereg alkoholowy, zanurzając je kolejno w alkoholu: 99,8%, 90%, 80%, 70% i 50%, a następnie w wodzie).

• Zanurz skrawki w 0,1‑procentowym roztworze zieleni trwałej na 5–10 minut.

• Przepłucz szkiełka 0,1‑procentowyn kwasem octowym przez 10–15 sekund.

• Zanurz szkiełka w 0,1‑procentowym roztworze safraniny na 20–30 minut.

• Wyczyść i odwodnij szkiełka (odwodnienie w etanolu 95% i 100%).

• Ściana komórkowa celulozowa:  barwa niebieskozielona

• Ściana komórkowa zdrewniała: barwa czerwona

Słownik

eozyna

eozyna

R4jtoFOJdS8OW1

Na ilustracji jest wzór strukturalny eozyny. Zbudowany jest między innymi z sześciu sześcioczłonowych pierścieni - jeden jest u góry wzoru, trzy przylegają do siebie w jednym rzędzie poniżej niego. Górny pierścień łączy się wiązaniem pojedynczym ze środkowym pierścieniem szeregu poniżej. Górny pierścień łączy się na dole po prawej stronie z grupą COO indeks górny minus. Środkowy pierścień zawiera atom tlenu. Pierścienie przylegające do niego łączą się u góry z boku oraz na dole z atomami bromu. Pierścień leżący po lewej stronie środkowego pierścienia łączy się dodatkowo wiązaniem pojedynczym z anionem tlenu, a pierścień leżący po prawej stronie łączy się wiązaniem podwójnym z atomem tlenu.

bromowa pochodna fluoresceiny; barwnik o właściwościach kwasowych, wykazujący silne powinowactwo do kwasochłonnych elementów komórki

hematoksylina

hematoksylina

RHUIxa2q5dmex1

Wzór strukturalny hematoksyliny. To przylegające do siebie pierścienie, z których jeden jest pięcioczłonowy, a pozostałe sześcioczłonowe. Skrajne dwa pierścienie mają po dwa wiązania podwójne i każdy z ich łączy się z dwiema grupami hydroksylowymi. Dwa środkowe pierścienie: sześcioczłonowy zawiera w swojej budowie atom tlenu. Styka się on z jednej strony z pięcioczłonowym pierścieniem. Na ich styku jest wiązanie pojedyncze prowadzące do grupy hydroksylowej.

naturalny barwnik pozyskiwany z amerykańskiego drzewa Erythroxylon campechianum; używa się jej w postaci złożonych roztworów zawierających sole glinu, żelaza, chromu lub wolframu; zawartość tych metali sprawia, że tkanka przyjmuje barwnik

safranina

safranina

RLnMIARhl08fp1

Na ilustracji jest wzór strukturalny safraniny. Zbudowany jest z trzech przylegających do siebie w jednym rzędzie sześcioczłonowych pierścieni. Środkowy pierścień łączy się od kationu azotu w dół wiązaniem pojedynczym z kolejnym pierścieniem. Środkowy pierścień zawiera dwa atomy azotu, jeden jest kationem. Pierścienie przylegające do niego po lewej i prawej stronie mają u góry po jednej grupie metylowej, na dole po jednej grupie aminowej pierwszorzędowej. W pierścieniu leżącym po lewej stronie wzory tych grup są zapisane od końca. W sąsiedztwie dolnego pierścienia znajduje się anion chlorkowy.

zasadowy barwnik organiczny, trwały (odporny na działanie światła, wody, mydła itp.), stosowany w histologii i cytologii, używany podczas barwienia kontrastowego; wiąże się z jądrami (DNA) i innymi polianionami tkankowymi oraz składnikami ligniny i plastydami w tkankach roślinnych