Przeczytaj

bg‑cyan

Biotechnologia molekularna

W biotechnologii molekularnej wykorzystywane są techniki inżynierii genetycznejinżynieria genetycznainżynierii genetycznej umożliwiające izolację materiału genetycznego zawierającego odpowiednie geny, manipulowanie nimi oraz wprowadzanie ich do docelowego organizmu. Manipulacja genetyczna umożliwia uzyskanie komórek o określonych cechach.

RnUI5yOsz5vKl1
Ilustracja przedstawia naprawy DNA przez ligazę DNA. Enzym ten przedstawiony jako niebiesko‑żółta struktura o nieregularnym kształcie łączy ze sobą dwa przerwane fragmenty łańcucha DNA w postaci podwójnej helisy.
Graficzne przedstawienie naprawy DNA przez ligazę DNA. Enzym ten łączy przerwane fragmenty DNA, zapobiegając niebezpiecznym uszkodzeniom materiału genetycznego. Właściwości tego enzymu wykorzystywane są podczas prac laboratoryjnych, m.in. w tworzeniu wektorów genetycznych, umożliwiających modyfikacje genetyczne.
Źródło: Tom Ellenberger, Wikipedia Commons, domena publiczna.

Wprowadzenie zmian w DNA wymaga wykorzystania enzymów. Najczęściej wykorzystywanymi w biotechnologii molekularnej enzymami są polimerazypolimerazy DNApolimerazy DNA, enzymy restrykcyjnerestryktazy, enzymy restrykcyjneenzymy restrykcyjne (należące do klasy enzymów nukleolitycznych) i ligazyligazyligazy.

Enzymy charakteryzują się specyficznością substratową. Oznacza to, że mają zdolność do łączenia się z konkretnymi substratami i katalizują reakcje po odpowiednim dopasowaniu substratu do centrum aktywnego enzymu. Efektem tego zjawiska jest dokładniejsza regulacja procesów zachodzących w komórkach.

Metody biotechnologii molekularnej są szeroko wykorzystywane w biotechnologii medycznej, rolniczej oraz przemysłowej.

Więcej o biotechnologii molekularnej w e‑materiałach:

bg‑cyan

Enzymy wykorzystywane w biotechnologii molekularnej

Polimerazy DNA

Polimerazy DNA katalizują wytwarzanie nowych, komplementarnych nici DNA lub ich naprawę. Działanie tych enzymów wymaga obecności matrycy (odcinka jednoniciowego DNA, który służy jako matryca do syntezy nowego, komplementarnego łańcucha) i przyłączonego do niej krótkiego komplementarnego odcinka kwasu nukleinowego (RNA lub DNA), nazywanego starterem (ang. primer). W warunkach naturalnych starter jest syntetyzowany przez enzym prymazę. Do tego odcinka przyłączane są przez polimerazę DNA kolejne nukleotydy, tworzące komplementarną do matrycy nić DNA.

Sekwencje starterów można zaprojektować i dokonać ich syntezy w taki sposób, aby polimeraza DNA syntetyzowała określony fragment DNA w trakcie reakcji łańcuchowej polimerazy z wykorzystaniem polimerazy termostabilnej.

W organizmach żywych występuje kilka typów polimeraz, które odpowiadają za syntezę nici wiodącej, nici opóźnionej, naprawę DNA czy syntezę DNA mitochondrialnego u organizmów eukariotycznych.

Występują także polimerazy DNA zależne od RNA. Enzymy te syntetyzują DNA na matrycy RNA. Przykładem takiego enzymu jest odwrotna transkryptaza, która służy do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) na podstawie cząsteczki mRNA. Otrzymane cDNA jest wykorzystywane m.in. w analizie ekspresji genów.

Restryktazy

Enzymy restrykcyjne, inaczej zwane endonukleazami restrykcyjnymi, tną nić DNA w miejscach wyznaczanych przez specyficzną sekwencję (najczęściej 4–6 nukleotydów). Restryktazy cechuje wysoka specyficzność substratowa. Cięcie nici DNA następuje w wyniku hydrolizy wiązań fosfodiestrowych. Enzymy te są izolowane z bakterii, u których pełnią funkcje obronne. Po wniknięciu wirusa do komórki bakteryjnej restryktazy niszczą jego materiał genetyczny.

Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne najczęściej są palindromowe, czyli posiadają oś symetrii. Oznacza to, że sekwencja odczytywana w kierunku 5'→3' na jednej nici jest identyczna z sekwencją odczytywaną w kierunku 5'→3' na nici komplementarnej. Do tej pory opisano kilka tysięcy restryktaz. Działanie enzymów restrykcyjnych może powodować powstawanie odcinków DNA o różnych końcach. W wyniku cięcia (np. enzymem SmaI) mogą powstawać dwuniciowe, tzw. tępe końce lub (na skutek cięcia np. enzymem EcoRI) jednoniciowe zakończenia, zwane lepkimi końcami. Dwie różne cząsteczki DNA przecięte tym samym enzymem restrykcyjnym mają lepkie końce komplementarne w stosunku do siebie.

Enzymy restrykcyjne można podzielić na trzy typy, w zależności od ich mechanizmu działania, substratów, produktów i kofaktorów. Do enzymów restrykcyjnych zalicza się:

  • typ I  – wielobiałkowe kompleksy posiadające aktywność restrykcyjną oraz metylotransferazową. Cięcie DNA zachodzi w znacznej odległości od rozpoznawanej sekwencji.

  • typ II  – enzymy mające zdolność do cięcia DNA w obrębie określonej, rozpoznawanej sekwencji. Rozpoznawane sekwencje stanowią palindromy. Niezbędnym kofaktorem do działania enzymów restrykcyjnych tej klasy są jony magnezu.

  • typ III  – enzymy dokonujące cięcia DNA w niewielkiej odległości od rozpoznawanej sekwencji. Występują w kompleksach z enzymami metylującymi DNA.

Najczęściej wykorzystywanymi enzymami restrykcyjnymi w inżynierii genetycznej są enzymy typu II. Jest to spowodowane dużą specyficznością wobec rozpoznawanej sekwencji i znanego miejsca cięcia. Dzięki temu można przewidzieć, jakie fragmenty DNA powstaną po cięciu restrykcyjnym.

Pierwszym odkrytym enzymem typu I był enzym z E.coli, ale pierwszym odkrytym i użytym w inżynierii genetycznej enzymem typu II był HindII z Haemophilus influenzae.

Nazwa

EcoRI

SmaI

Sekwencje
rozpoznawane
przez enzymy
restrykcyjne

5′ GAATTC 3′
3′ CTTAAG 5′

5′ CCCGGG 3′
3′ GGGCCC 5′

Końce

Lepkie końce
5′ G 3′ 5′ AATTC 3′
3′ CTTAA 5′ 3′ G 5′

Tępe końce
5′ CCC 3′ 5′ GGG 3′
3 GGG 5′ 3′ CCC 5′

Ligazy

Ligazy są grupą enzymów, które katalizują powstawanie nowych wiązań fosfodiestrowych pomiędzy deoksyrybonukleotydami zawartymi w niciach DNA z wykorzystaniem energii, np. z ATP. Łączą pęknięte nici DNA, ale także fragmenty powstałe w wyniku działania enzymów restrykcyjnych. Proces ten, nazywany ligacją, jest wydajniejszy, jeżeli dotyczy cząsteczek z lepkimi końcami.

R1Ev4QHijhELC
Ilustracja przedstawia działanie ligazy. Matrycowe DNA, mające lepkie końce, jest łączone ze wstawką, która również ma lepkie końce. Powstaje zrekombinowane DNA.
Schemat przedstawiający działanie ligazy.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z.o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.

Wykorzystanie wszystkich opisanych enzymów można przedstawić na przykładzie tworzenia wektorów genetycznychwektor genetycznywektorów genetycznych.  Zarówno plazmid pełniący funkcję wektora, jak i fragment DNA zawierający wybrany gen, uprzednio namnożony metodą PCR, poddaje się trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Powoduje to powstanie fragmentów DNA z komplementarnymi lepkimi końcami. Następnie ligaza DNA łączy oba fragmenty, tworząc rekombinowany wektor genetyczny zawierający sekwencję badanego genu. Taki wektor może zostać wykorzystany do wprowadzenia genu do komórki, np. bakteryjnej.

Enzymy restrykcyjne znajdują również zastosowanie w diagnostyce molekularnej. Mutacje zmieniające sekwencje rozpoznawane przez określone restryktazy mogą prowadzić do powstawania fragmentów DNA o różnej długości po trawieniu. Różnice te można wykryć metodą elektroferezyelektroforeza DNAelektroferezy, co umożliwia identyfikację określonych zmian genetycznych.

1
RARy0ZOZtgb9o
Ilustracja interaktywna przedstawia działanie enzymów restrykcyjnych. Nad schematem widnieje napis: Tępe i lepkie końce. Na górze schematu znajduje się ułożona poziomo drabinka - dwie równoległe linie połączone ze sobą prostopadłymi, krótkimi odcinkami. Na jej początku, przy górnej linii znajduje się cyfra 5 i apostrof, na końcu cyfra 3 i apostrof. Przy dolnej linii na jej początku znajduje się cyfra trzy apostrof, na jej końcu cyfra 5 i apostrof. Pod drabinką znajduje się cyfra 1 z opisem: enzym restrykcyjny rozpoznaje i tnie sekwencję. Jedna ze strzałek od tego miejsca skierowana jest w prawo. Wyżej opisana drabinka na kolejnej ilustracji przedzielona jest równo na pół, do miejsca przecięcia prowadzi skierowana w górę strzałka z podpisem: tępe końce. Pod spodem znajdują się dwie równoległe do siebie sekwencje liter: w górnym rzędzie N‑N-A‑G-C‑T-N‑N, w dolnym rzędzie N‑N-T‑C-G‑A-N‑N. Do ośrodka tych sekwencji, od góry i od dołu prowadzą dwie niewielkie, zielone strzałki. Od tego ciągu liter prowadzi czarne strzałka w bok z napisem Smal do sekwencji tych samych liter, rozdzielonej w połowie - w górnym rzędzie N‑N-A‑G przerwa C‑T-N‑N, w dolnym rzędzie N‑N-T‑C przerwa G‑A-N‑N. Pomiędzy nimi znajduje się napis: tępe końce. Przy tej ilustracji znajduje się cyfra 2 i opis: Końce są tępe, gdy przecięcie przechodzi przez te same miejsca obu naprzeciwległych nici DNA. Od cyfry 1 na schemacie biegnie druga strzałka skierowana jest w lewo. Wyżej opisana drabinka na kolejnej ilustracji przedzielona jest pod skosem – przecięcie jest przesunięte względem siebie. Pod spodem znajdują się dwie równoległe do siebie sekwencje liter: w górnym rzędzie N‑N-G‑A-A‑T-T‑C-N‑N, w dolnym rzędzie N‑N-C‑T-T‑A-A‑G-N‑N. Do tych sekwencji, od góry i od dołu prowadzą dwie niewielkie, zielone strzałki. Grot strzałki w przypadku górnego łańcucha znajduje się za literką G, dolnej za ostatnią literką A. Od tego ciągu liter prowadzi czarne strzałka w bok z napisem EcoRI do sekwencji tych samych liter, rozdzielonej w przypadku górnego łańcucha za literką G, a w przypadku dolnego łańcucha za ostatnią literką A. Pod spodem widnieje napis: Lepkie końce. Przy tej ilustracji znajduje się cyfra 3 i opis: Końce są lepkie, gdy przecięcie jest przesunięte względem siebie np. o kilka nukleotydów.
Schemat przedstawiający działanie enzymów restrykcyjnych.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
RRr8Bt7e0SmRj
Schemat ilustruje zastosowanie enzymów restrykcyjnych do wykrywania mutacji powodującej anemię sierpowatą. Na pierwszym obrazku przedstawiona jest drabinka – dwie równoległe linie połączone ze sobą prostopadłymi do nich odcinkami przedzielonymi na pół i pasującymi do siebie jak puzzle. Kolejno odcinek oznaczony jako C połączony jest odcinkiem G, odcinek oznaczony jako T z odcinkiem A, G z C, A z T oraz C z G. Czwarty odcinek AT znajduje się w ramce. Nad drabinką widoczne są dwie strzałki – górna skierowana grotem w dół znajduje się nad odcinkiem TA, dolna skierowana grotem do góry pod odcinkiem CG. Ilustracja podpisana jest: prawidłowy gen beta‑globinowy. Obok znajduje się taka sama drabinka, jednak czwarta para z ramki jest odwrócona – symbol T znajduje się nad A. Obok widnieje podpis: zmutowany gen beta‑globinowy. Od tych dwóch ilustracji w dół prowadzi gruba, szara strzałka. W kolejnym rzędzie na pierwszej ilustracji znajduje się wyżej opisana drabinka, jednak jest ona rozłączona pod skosem - drugi, trzeci i czwarty odcinek: TA, GC i AT jest przecięty w połowie. Obok znajduje się napis: cięcie enzymem restrykcyjnym, a także cyfra jeden i opis: u osoby z prawidłowym genem beta‑globinowym enzymy restrykcyjne przecięły nić DNA w miejscu wyznaczonym przez specyficzną sekwencję. Obok widoczna jest grafika obrazująca zmutowany gen beta‑globinowy z wiersza powyżej. Z prawej strony grafiki widnieje napis: brak cięcia enzymem restrykcyjnym. Od tych ilustracji prowadzi w dół szara, gruba strzałka z napisem elektroforeza. Na pierwszej ilustracji w kolejnym rzędzie znajduje się prostokąt z dwoma równoległymi do siebie, krótkimi, poziomymi liniami w kolorze niebieskim. Obok prostokąta znajduje się napis: dwa krótkie prążki (szybciej wędrują w żelu). W drugim, znajdującym się obok, takim samym prostokącie na górze widoczna jest dłuższa, niebieska linia. Obok widnieje tekst: jeden krótki prążek (wolniej wędruje w żelu).
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do wykrywania mutacji powodującej anemię sierpowatą.
Źródło: Englishsquare.pl Sp. z o.o., licencja: CC BY-SA 3.0.
Ważne!

W 1955 r. Arthur Kornberg odkrył polimerazę DNA (polimeraza DNA I). Odkrycie to było przełomowe. Na podstawie kolejnych badań wykazano rolę polimerazy Kornbergapolimeraza Kornbergapolimerazy Kornberga w procesie replikacji i naprawy DNA.

W 1969 r. Thomas Brock odkrył odkrył bakterię Thermus aquaticus, żyjącą w gorących źródłach Yellowstone. Z tej bakterii później wyizolowano polimerazę DNA Taq. Enzym ten nie traci aktywności nawet w temperaturze około 95°C. Jego termostabilność umożliwiła opracowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stosowanej do amplifikacji DNA. .

RFxYEJyfJUkO0
Zdjęcie spod mikroskopu elektronowego przedstawia podłużne komórki bakterii Thermus aquaticus. Znajdują się one na szarej powierzchni.
Thermus aquaticus. Mikroskop elektronowy, powiększenie 1000×.
Źródło: Saperaud, Wikimedia Commons, domena publiczna.

Słownik

elektroforeza DNA
elektroforeza DNA

rozdział cząsteczek DNA w żelu pod wpływem pola elektrycznego

fragment Klenowa
fragment Klenowa

fragment polimerazy Kornberga, zachowujący aktywność naprawczą egzonukleazy 3′→5′ i aktywność polimeryzacyjną polimerazy Kornberga

inżynieria genetyczna
inżynieria genetyczna

eksperymentalna dziedzina z pogranicza genetyki i biologii molekularnej posługująca się zespołem różnorodnych technik, polegających na manipulowaniu DNA in vitro oraz in vivo w celu uzyskania dziedzicznych zmian w komórkach lub całych organizmach

izoschizomery
izoschizomery

enzymy restrykcyjne, które zawsze rozpoznają taką samą sekwencję DNA i przecinają ją w taki sam sposób

ligacja
ligacja

połączenie końca 3’ jednego łańcucha polinukleotydowego z końcem 5’ innego łańcucha kowalencyjnym wiązaniem fosfodiestrowym

ligazy
ligazy

klasa enzymów katalizująca wytwarzanie wiązań pomiędzy dwiema cząsteczkami, połączone z rozpadem wiązania wysokoenergetycznego

neoschizomery
neoschizomery

enzymy restrykcyjne, które zawsze rozpoznają taką samą sekwencję DNA, ale tną ją w zupełnie inny sposób

polimeraza Kornberga
polimeraza Kornberga

polimeraza DNA I odkryta w 1955 r. przez Arthura Kornberga; enzym, który  dosyntetyzowuje luki między fragmentami Okazaki

polimerazy DNA
polimerazy DNA

enzymy należące do nukleotydylotransferaz, syntetyzujące z odpowiednich trifosforanów nukleozydów cząsteczki kwasów deoksyrybonukleinowych według wzoru zakodowanego w materiale genetycznym organizmu

reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR)
reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR)

technika laboratoryjna biologii molekularnej pozwalająca na powielanie wybranego odcinka DNA in vitro

restryktazy, enzymy restrykcyjne
restryktazy, enzymy restrykcyjne

enzymy, które rozpoznają określone kilkunukleotydowe sekwencje łańcucha DNA obcego dla komórki i wycinają je, rozkładając hydrolitycznie wiązanie fosfodiestrowe w tych odcinkach łańcucha; przecięcie może być tzw. tępe, gdy przechodzi przez te same miejsca obu naprzeciwległych nici DNA, lub tzw. lepkie, gdy cięcia w obu niciach są przesunięte względem siebie np. o kilka nukleotydów; własny DNA bakterii jest chroniony przed rozkładem

wektor genetyczny
wektor genetyczny

najczęściej koliste cząsteczki DNA plazmidów i wirusów mające zdolność do wnikania i autonomicznej replikacji w danym typie komórki

Wprowadzenie
Film